以 CRISPR/Cas9 为代表的基因编辑技术为动植物育种提供了革命性工具，但是基因敲除和碱基编辑是目前基因编辑技术应用的两个主要场景。由于基因编辑的最终产品不含外源基因，并且也可以通过传统诱变或自然突变获得，因此基因编辑作物在很多国家被视为普通品种。而如果能够在不插入人工DNA 的前提下实现上调基因表达，将开辟基因编辑技术应用的另一重要领域— “基因敲高”。但是，传统观点认为该技术路线很难实现。
早期研究表明，Cas9 同时在一个基因的不同位置切割时，会造成删除、倒位、重复等基因组结构变异。本研究团队突然意识到，只要在所要上调表达的目标基因（下图所示的基因-1）附近找到高表达基因（下图所示的基因-2）并选择恰当的位点切割，就能够创造出特定的结构变异，将高表达基因的启动子与目标基因连接形成新的基因表达模式，将有望大幅上调目标基因的表达，实现“基因敲高”。此外，自然界中大量存在通过结构变异上调基因表达的自发突变。但是，能否利用基因编辑技术通过创制结构变异的方式 “敲高”基因，目前尚未有报道。
鉴于在水稻中过表达水稻 PPO1 和HPPD 能够分别带来对两种专利除草剂（中国自主知识产权）的抗性，本研究的核心问题是，如何在不整合人工 DNA（作为强启动子）的前提下，利用基因编辑技术大幅“敲高”这两个基因的表达。研究人员根据水稻转录组信息，分别在 PPO1 和HPPD 附近找到了高表达基因 CP12 和 Ubiquitin2，构建了双靶点CRISPR 载体对水稻愈伤进行了大规模转化，成功创制了两种不同且可以稳定遗传的基因组结构变异。在被成功编辑的水稻植株中，CP12基因的启动子驱动 PPO1 基因，Ubiquitin2 基因的启动子驱动HPPD 基因，极大地“敲高”了水稻内源 PPO1 和HPPD 基因的表达，使水稻植株表现出预期的抗除草剂性状。
本研究进一步深化了对CRISPR工具的认知和理解，将其功能从“基因敲除”拓展到“基因敲高”。鉴于大量的基因通过提升其表达量即可带来性状的改良，因此，“基因敲高”有望成为CRISPR技术在动植物育种上应用的新领域。
我校植物保护学院2021届毕业生芦钰硕士、青岛清原化合物有限公司王继尧博士、陈波博士、莫苏东博士和贵州大学博士研究生连磊为本文的共同第一作者，植物保护学院姜临建副教授、青岛清原化合物有限公司李华荣博士、中国科学院分子植物科学卓越创新中心朱健康教授和贵州大学宋宝安教授为本文的共同通讯作者，青岛华大基因范广益博士、孙帅作为本文的共同作者提供了测序结果的生信分析。本研究得到了清原化合物公司和国家自然科学基金的资助。
