针对这个问题，青岛能源所咸漠研究员带领的材料生物合成技术中心基于“剪刀石头布”策略实现了免筛选标记/质粒消除步骤的多轮基因编辑方法，相关成果近日发表于国际高影响刊物Nucleic Acids Research。本研究构建了三个能够循环消除的基因编辑辅助质粒（pRock，pPaper，pScissors），在按照“剪刀-石头-布”顺序分别使用这三个质粒实施基因编辑时，可以同时去除上一轮基因编辑中使用的辅助质粒，从而免除了传统方法中的筛选标记或者质粒消除步骤，极大地提高了多轮编辑的速度（图1）。质粒消除效率可达到99.99-100%，几乎不会有逃逸情况。另外该系统还存在双重检查机制：如上一轮发生了逃逸的情况，由于质粒间的拮抗作用则不能进行下一轮编辑。本研究在大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌中对该方法进行了测试，快速完成了多轮的敲除、插入、替换等基因编辑操作。
利用本方法进行连续多轮基因编辑时，每一轮编辑仅需要进行两次培养，即一次平板培养和一次单克隆液体培养（图2），这几乎是精细基因编辑所需要的最少培养次数。这不仅极大地缩短了基因编辑周期，还减少了基因组随机突变的可能性，这些优势在进行大规模多轮基因编辑时尤为明显。本方法是目前最快最鲁棒的多轮基因编辑策略，可与现有其它CRISPR/Cas9编辑优化策略进行联合使用并且在未来更易于实现自动化，同样策略也可以用于其它物种的基因编辑。
材料生物合成技术中心博士后王纪超、硕士研究生隋新悦为本论文的共同第一作者，赵广研究员和咸漠研究员为本论文共同通讯作者。该工作得到了国家自然科学基金委、国防科工局等项目的资助。（文/图 隋新悦 王纪超）
图1. 基于“剪刀石头布”策略的多基因编辑方法示意图。A. 三个能够循环消除的基因编辑辅助质粒，在实施基因编辑的同时能消除上一轮的质粒。 B. 相较于传统方法，本方法不需要单独的筛选标记或质粒消除步骤。
图2. 基于“剪刀石头布”策略的多轮基因编辑流程图。A. “剪刀石头布”基因编辑辅助质粒构建流程图。B. 连续多轮基因编辑步骤流程图。
本研究相关质粒可从第三方开放获取：MolecularCloud (www.molecularcloud.org)，MC_0101139, MC_0101140，MC_0101141。建议同时获取MC_0000011以及MC_0000012。
原文链接：https://doi.org/10.1093/nar/gkaa1141
Jichao Wang, Xinyue Sui, Yamei Ding, Yingxin Fu, Xinjun Feng, Min Liu, Youming Zhang, Mo Xian, Guang Zhao, A fast and robust iterative genome-editing method based on a Rock-Paper-Scissors strategy, Nucleic Acids Research, 2020, DOI: 10.1093/nar/gkaa1141
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