东北大学 资源与土木工程学院，辽宁 沈阳 110819
收稿日期：2021-11-12
基金项目：中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(N2101041)。
作者简介：金长宇(1979-)，男，辽宁鞍山人，东北大学教授，博士生导师。
摘要：提出一种利用微生物诱导碳酸钙沉淀(MICP)技术的胶结尾砂方法，利用兼性厌氧菌在密封养护条件下胶结尾砂，解决利用好氧菌无法在缺氧或无氧环境下使用的问题.采用控制变量法对利用兼性厌氧菌MICP技术胶结尾砂试验的影响因素进行探究，研究了菌液浓度、胶结溶液浓度、尾砂粒径和养护温度对胶结效果的影响.结果表明：当菌液的OD600为1、胶结溶液中醋酸根离子浓度为0.6 mol/L、尾砂为多种不同粒径的尾砂混合体、养护温度为30 ℃时，胶结效果最佳；兼性厌氧菌的MICP技术具有胶结尾砂的潜力，为替代水泥作为尾砂胶结材料提供了有效途径.
关键词：兼性厌氧菌诱导碳酸钙尾砂充填体
Experimental Study on Tailings Reconstructed Backfill Based on Facultative Anaerobic Bacteria MICP Technology
JIN Chang-yu, FENG Qing-jie, WANG Qiang
School of Resources & Civil Engineering, Northeastern University, Shenyang 110819, China
Abstract: A tailing gluing method based on microbial induced calcium carbonate precipitation(MICP)technology was presented. Facultative anaerobic bacteria was used to glue tailing in sealed curing conditions, aiming to solve the problem that aerobic bacteria cannot be used in anoxia or anaerobic environment. The control variable method was used to explore the influencing factors of facultative anaerobic bacteria MICP technology in glue tailing test, in which four influencing factors were studied, namely the concentration of bacteria solution, the concentration of cementing solution, the particle size of tailing and the curing temperature. The results show that when the OD600 of the bacterial liquid is 1, and the concentration of acetate ion in the cementing solution is 0.6 mol/L, the tailings is a mixture of tailings with various particle sizes, and when the curing temperature is 30 ℃, the cementing effect is best. It is found that the MICP technology of facultative anaerobic bacteria can effectively cementing tailings, which provides a solution for replacing cement by tailings cementing material.
Key words: facultative anaerobic bacteriainducecalcium carbonatetailingbackfill
矿产资源是人类生活与发展经济的必需品.随社会的不断进步，全球对矿产资源的需求量逐渐增大，矿山的浅部资源逐渐被开采殆尽，露天开采向地下开采转型[1]，开始对深部资源进行开采.地下开采必然会在底层中产生大量的采空区，由采空区岩层失稳造成的安全事故时有发生.除此之外，地下水位下降、地表下沉、尾矿库污染成为了地下开采过程中非常棘手的问题[2].为了解决上述问题，充填采矿法已成为地下资源开采的首选方法，其中尾砂胶结充填不但能处理尾砂等固体废弃物，还有效减少环境污染和尾矿库管理成本，同时尾砂胶结体作为支撑结构能明显改善采场围岩稳定性，极大提高井下开采的安全与效率[3].
尾砂胶结充填体是将选厂尾砂骨料与胶结料和水按一定质量比例混合搅拌，通过充填管道输送到地下硬化后形成的胶结体.目前矿山广泛使用的胶结料为硅酸盐水泥，大量的硅酸盐水泥充填到井下会使地下水的酸碱度提高，污染地下水，并且水泥的生产不可避免地要产生碳排放.据统计水泥行业所产生的二氧化碳约占全球人为二氧化碳排放量的6%，在我国这一比例更是增大到20%，成为了主要温室气体排放行业之一[4].因此寻找能够替代硅酸盐水泥的尾砂胶结料成为了亟需解决的热门问题.
微生物诱导碳酸钙沉淀(microbial induced calcite precipitation，MICP)技术是一种典型的生物矿化作用，在一定的物理化学条件及生物有机质的控制或影响下，将溶液中的钙离子转变为以碳酸钙为主的固相矿物.MICP技术的作用机理众多，主要有尿素水解作用、反硝化作用、铁盐还原作用、硫酸盐还原作用、光合作用等，其中以尿素水解作用应用较为广泛.尿素水解作用是指一些特定的微生物(脲酶菌)在新陈代谢过程中持续产生高活性的脲酶，脲酶分解尿素产生二氧化碳提高环境碱度，促进环境中的Ca2+沉淀为碳酸钙晶体.基于尿素水解作用的MICP技术机理相对较为简单，可以在短时间内生成大量碳酸钙沉淀，具备效率高、可持续发展、对环境无污染等特点，因此备受国内外****关注[5-6].Whiffin[7]于2004年率先提出利用微生物诱导碳酸钙沉淀技术胶结砂土颗粒，改善砂土体的强度和刚度；Chu等[8]研究发现通过微生物诱导碳酸钙沉淀技术胶结固化后的砂柱的单轴抗压强度与碳酸钙沉淀量之间存在正比关系，并给出二者之间的线性经验公式.van Paassen等[9]对100 m3的大规模砂土体进行MICP注浆法加固实验，通过12天的循环注浆后，约有一半体积的砂土胶结在一起，呈透镜体状态，经过测量得到生成的碳酸钙含量约为110 kg/m3，砂样试件的单轴抗压强度最大可达12.4 MPa，表明MICP技术可大幅度提高砂土体的力学强度.诸多国内外****利用MICP技术对水泥基、土体、砂体等不同材料的修复与加固进行了研究[10-11]，多使用好氧菌(巴氏芽孢杆菌)的MICP技术，采用表面涂刷法、注浆法及浸泡法对材料进行修复和加固.涂刷法多用于表面缺陷修复，无法对内部进行加固；注浆法虽然能够有效对土体或砂体进行整体胶结加固，但注浆法成本较高、工艺较复杂，很难应用到对地下矿山充填体的胶结加固中；浸泡法需要消耗大量胶结溶液，且成本较高、均匀性难以控制.地下采空区多为缺氧或无氧环境，如果利用微生物诱导碳酸钙沉淀技术加固尾砂作为充填体材料，所用微生物必须在缺氧或无氧环境生存.常用的脲酶菌(如巴氏芽孢杆菌)属于好氧菌，在地下缺氧环境中脲酶活性会迅速下降，不适合在地下采空区中应用[12].因此，寻求一种可以诱导碳酸钙沉淀的兼性厌氧菌对尾砂充填体进行胶结成为该项问题研究的关键.
根据已有微生物诱导碳酸钙的研究成果，采用兼性厌氧菌(反硝化卡斯特兰尼氏菌)在密封养护情况下诱导碳酸钙沉淀对尾砂进行胶结，研究菌液浓度、胶结溶液浓度、尾砂粒径和温度对胶结效果的影响.利用力学试验对胶结后的尾砂试件强度进行测试，采用XRD对胶结后的产物进行分析，确定利用兼性厌氧菌的MICP技术在密封养护的情况下胶结尾砂的可行性.
1 试验机理与原料1.1 试验机理采用一种兼性厌氧菌(反硝化卡斯特兰尼氏菌)的反硝化作用生成碳酸钙，对尾砂进行胶结.反硝化细菌是一种典型的兼性厌氧菌，在缺氧环境下，反硝化细菌能促使硝酸根接受电子，还原成氮气，同时消耗环境中的氢离子，生成二氧化碳，从而提高环境碱度.在碱性条件下，溶液中的碳酸氢根与钙离子结合生成沉淀.文献[13-14]采用革兰氏阴性、兼性厌氧菌(Pseudomonas denitrificant)在液体培养基、琼脂平板和砂柱等不同条件下的反硝化作用诱导生成碳酸钙沉淀试验，验证了利用反硝化菌进行MICP的可行性.
1.2 试验原料1.2.1 尾砂使用的尾砂取自辽宁省鞍山市某铁矿的尾矿库.利用X射线荧光(XRF)分析对尾砂主要化学成分进行测定，主要化学成分如表 1所示.采用X射线衍射(XRD)分析对尾砂晶体物相进行鉴定，如图 1所示，其主要矿物成分为石英、梅林石和铜钴矿物等.为研究尾砂粒径对胶结情况的影响，在确保尾砂成分不变的情况下，将原尾砂使用立式行星球磨机(XQM-4L)分别研磨30，60，90 min，并将原尾砂和研磨的3种尾砂按质量比1∶1∶1∶1混合后配制出新粒径配比的尾砂.采用激光粒度分析仪(Mastersizer3000，英国马尔文公司)对5种尾砂样品的粒度分布进行了分析，结果如图 2所示.
表 1(Table 1)
 表 1 尾砂中主要化学成分及含量(质量分数)Table 1 Main chemical composition and content in tailings(mass fraction)?
| 表 1 尾砂中主要化学成分及含量(质量分数) Table 1 Main chemical composition and content in tailings(mass fraction)? | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
图 1(Fig. 1)
 | 图 1 尾砂XRD图谱Fig.1 XRD pattern of tailings |
图 2(Fig. 2)
 | 图 2 不同研磨时间尾砂粒径分布Fig.2 Size distribution of tailings with different grinding time |
1.2.2 微生物使用的微生物为反硝化卡斯特兰尼氏菌(Castellanielladenitrificans)，来自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CGMCC 1.10720，反硝化卡斯特兰尼氏菌是一种革兰氏阴性的兼性厌氧菌.微生物采用蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、牛肉提取物3 g/L的营养肉汁培养基进行培养，配置好的培养基将其pH调整到7.0.培养基在高温灭菌锅(型号YXQ-L-50S11)内灭菌后，带到无菌操作台中进行试验.将活化后的反硝化卡斯特兰尼氏菌分别接种到无菌培养基中，在振动培养箱(型号SHZ-82A)中培养24 h，温度为30 ℃，振荡频率为140 r/min.
1.2.3 胶结溶液胶结溶液是为微生物生存、诱导碳酸钙沉淀反应提供营养和化学物质的液体介质.根据反硝化作用机理，胶结溶液使用硝酸钙、醋酸钙和氯化钙提供CH3COO-，NO3-和Ca2+，并加入适量的营养肉汤为微生物提供营养物质.根据反硝化作用反应机理将CH3COO-与NO3-按浓度比1∶1.6配制，加入适量的氯化钙，使Ca2+的物质量的浓度为1.5 mol/L.
2 试验方法2.1 胶结方法首先将培养24 h后的反硝化卡斯特兰尼氏菌液从恒温震荡箱中取出，使用紫外分光光度计(型号UVmini-1240)测定菌液在波长600 μm时的光度值(即OD600)；再将一定量的硝酸钙、醋酸钙、氯化钙和营养肉汤溶解在新鲜培养基内备用，将反硝化卡斯特兰尼氏菌液在高速离心机(型号5424R)中以6 000 r/min的转速离心5 min，倒掉上层清液.根据计算加入一定体积的培养基与胶结溶液混合液，充分混合后得到不同OD600值的菌液，由于菌液浓度与菌液的OD600值成正比，可以用菌液的OD600值来表征不同的菌液浓度.将预先干燥的尾砂与菌液按照固体质量比为75%混合搅拌，将混合后的尾砂装入内径50 mm，高度100 mm的模具内，对模具侧壁和两端进行密封.将密封好的模具放入恒温干燥箱内在恒定温度下密封养护28 d，待养护结束后打开模具，将恒温干燥箱温度调到70 ℃对试件进行烘干，脱模后进行后续试验，分析尾砂试件的胶结效果.尾砂试件的制备流程如图 3所示.
图 3(Fig. 3)
 | 图 3 尾砂试件的制备Fig.3 Preparation of tailings specimens |
2.2 力学测试对胶结后的尾砂试件进行单轴压缩试验和直剪试验.单轴压缩测试仪器采用美国Humboldt HM-5030加载试验机，其压力传感器精度为0.01 N，位移传感器测量精度为0.001 mm，最大加载能力为50 kN.直剪试验采用东北大学岩石力学实验室的YAW-3000微机控制电液伺服岩体直剪仪，法向应力为0.25 MPa.试验中试件均采用尺寸为50 mm×100 mm的圆柱体试件，每组试件均选取5个试件做相同测试并取平均值，得到在不同条件下尾砂试件的力学参数，分析各因素对胶结效果的影响.
2.3 XRD分析利用兼性厌氧菌MICP技术密封养护可以生成CaCO3，对胶结后的尾砂试件进行X射线衍射分析.X射线衍射分析采用东北大学研究院分析测试中心的多晶X射线衍射仪，型号：X'Pert Pro；生产厂商：荷兰帕纳科公司；功率：3 kW；样品台：计算机控制5轴马达驱动；探测器：超能探测器；测角台：光学编码；全数字化计算机控制系统.为了避免取样时的偶然因素，在胶结后的尾砂试件的不同位置选取样本，将其在70 ℃下烘干后粉碎.测试得到的XRD图谱与原尾砂的XRD图谱进行对比，分析成物成分.
2.4 碳酸钙含量测试在胶结后的尾砂试件中，wCaCO3直接影响到试件的胶结效果和力学性能，通过测试wCaCO3，分析尾砂试件的胶结情况.分析MICP技术所形成的CaCO3的均匀性，根据文献[15]将胶结后的尾砂试件划分为4个部分，结果如图 4所示.将试件按部分分割后分别用研钵研磨成粉末，放入烘箱烘干，记录此时的质量为m1.将烘干后的试件粉末用去离子水浸泡洗涤后放入烘箱烘干，记录此时的质量为m2，然后将其放入0.1 mol/mL HCl溶液中浸泡洗涤，直至无气泡.用去离子水洗涤、过滤并烘干，测得质量为m3.第二、三次测量的差值便是试件中所含CaCO3的质量.再根据原始试样计算出试样中wCaCO3，如式(1)所示.每组试件均选取5个试件做测试并取其平均值.
 | (1) |
 | 图 4 尾砂试件分布情况Fig.4 Location of tailings specimens |
3 试验结果与讨论3.1 菌液浓度对胶结效果的影响由于菌液浓度与菌液光度值成正比，采用菌液在波长600 μm时的光度值(即OD600)表征菌液浓度.将培养24 h的菌液离心后，根据计算分别加入不同体积的培养基，用OD600分别为0.25，0.50，0.75，1.00和1.25的5种不同的菌液对尾砂进行胶结.为控制变量的唯一性，胶结溶液中cCH3COO-为0.6 mol/L，尾砂均使用未经过研磨的原尾砂，并均在30 ℃下养护28 d.试件烘干后测定其单轴抗压强度、直剪强度和各部分wCaCO3并取平均值，结果如图 5所示.
图 5(Fig. 5)
 | 图 5 试件胶结效果与菌液浓度的关系Fig.5 Relationship between cementing effect of speciment and bacterial solution concentration |
由图 5可知，随菌液浓度的增加，单轴抗压强度、直剪强度和试件各部分wCaCO3均呈上升趋势，OD600值从0.25增加到1.00时，单轴抗压强度、直剪强度和试件各部分wCaCO3均增加较快，说明菌液的OD600值低于1.00时，菌液浓度的增加对尾砂的胶结效果有显著提升.OD600由1.00增加到1.25时，单轴抗压强度和直剪强度基本维持不变，wCaCO3变化也相对较小，说明当菌液的OD600值大于1.00时，受其他因素影响，菌液浓度的增加不能显著提升对尾砂的胶结效果.在相同条件下经过浸泡或注浆养护方式得到试件的单轴抗压强度为0.5~1.2 MPa，但两种方法均无法适应井下缺氧或无氧环境；密封养护方式形成试件的单轴抗压强度可达1.01 MPa，适用于缺氧或无氧环境，具备胶结尾砂再造充填体的潜力.
3.2 胶结溶液浓度对胶结效果的影响分别配置物质的量浓度为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mol/L的胶结溶液，将其与OD600值为1.00的菌液等体积混合后，再将混合后溶液与未经过研磨的原尾砂进行混合制备试件.所有试件在30 ℃的条件下养护28 d，试件烘干后测定其单轴抗压强度、直剪强度和各部分wCaCO3并取平均值，结果如图 6所示.
图 6(Fig. 6)
 | 图 6 试件胶结效果与胶结物质的量浓度的关系Fig.6 Relationship between cementing effect of specimen and ccem |
由图 6可知，随胶结物质的量浓度的增加，单轴抗压强度、直剪强度和试件各部分的wCaCO3均呈先增加后减小的趋势，并在cCH3COO-为0.6 mol/L时，微生物对尾砂的胶结效果最佳.当胶结溶液中cCH3COO-超过0.6 mol/L后，单轴抗压强度、直剪强度和试件各部分的wCaCO3均迅速下降，说明当胶结物质的量浓度过高时，高物质的量浓度的cCH3COO-会抑制反硝化卡斯特兰尼氏菌的生长、繁殖，从而影响微生物对尾砂的胶结作用.
3.3 尾砂粒径对胶结效果的影响使用立式行星球磨机将原尾砂分别研磨30，60，90 min，并将原尾砂和研磨的三种尾砂按质量比1∶1∶1∶1混合后配制出新的粒径配比的尾砂，得到原尾砂.研磨30，60，90 min和1∶1∶1∶1的5种成分相同但粒径不同的尾砂，使用OD600值为1.00的菌液和cCH3COO-为0.6 mol/L的胶结溶液分别对不同粒径的尾砂进行胶结，并将所有试件在30 ℃下养护28 d.试件烘干后测定其单轴抗压强度、直剪强度和各部分wCaCO3取平均值，结果如图 7所示.
图 7(Fig. 7)
 | 图 7 试件胶结效果与尾砂粒径的关系Fig.7 Relationship between cementing effect of specimen and particle size of tailings |
由图 7可知，同样的条件下，微生物对不同粒径的尾砂按质量比1∶1∶1∶1混合体胶结效果最好，原尾砂次之，研磨时间最长的尾砂胶结效果最差，并出现个别试件不成型的现象.微生物在诱导碳酸钙沉淀胶结尾砂时需要一定的生存空间，原尾砂粒径较大，尾砂颗粒与颗粒之间的空隙较多，胶结效果相对较好.不同粒径的尾砂按质量比1∶1∶1∶1混合体相比较原尾砂除了有足够大颗粒支撑下的空隙，还有部分小粒径尾砂在其中起到细骨料的作用，使微生物诱导形成的碳酸钙颗粒更有效地将尾砂胶结在一起.
3.4 温度对胶结效果的影响将OD600值为1.00的菌液、cCH3COO-为0.6 mol/L的胶结溶液和原尾砂进行混合搅拌，制备成试件后，分别放入温度为20，25，30，35，40 ℃的恒温养护箱内养护28 d，得到试件烘干后测定其单轴抗压强度、直剪强度和各部分wCaCO3并取平均值，结果如图 8所示.
图 8(Fig. 8)
 | 图 8 试件胶结效果与温度的关系Fig.8 Relationship between cementing effect of specimen and temperatures |
由图 8可知，养护温度为30 ℃时，在试件中微生物诱导生成的wCaCO3最大，并且单轴抗压强度和直剪强度也是最大的，说明30 ℃是反硝化卡斯特兰尼氏菌诱导碳酸钙沉淀胶结尾砂的最佳养护温度.当养护温度低于或高于30 ℃时，胶结效果会随之下降，高于30 ℃时，下降速率较快.
3.5 生成物成分与分布利用兼性厌氧菌MICP技术，在密封养护条件下确定生成物的成分，对胶结后的尾砂试件进行X射线衍射分析，并与原尾砂的XRD图谱进行对比，如图 9所示.可知在胶结后的尾砂试件中生成了碳酸钙，并多以方解石的形式存在.胶结后尾砂试件的单轴抗压强度和直剪强度的变化趋势与各部分wCaCO3的变化趋势相同，试件各部分wCaCO3有明显差别，将所有条件下各部分wCaCO3进行统计，如图 10所示.在密封养护条件下，利用兼性厌氧菌MICP技术胶结后的尾砂试件中，内部(区域Ⅲ)生成的碳酸钙最多、力学性质最强；试件底部(区域Ⅳ)、顶部(区域Ⅰ)及试件的侧壁(区域Ⅱ)由于模具无法做到完全隔绝氧气，反硝化卡斯特兰尼氏菌无法进行反硝化作用，导致侧壁碳酸钙生成量最低，力学性质最差，个别试件存在表面脱皮现象.
图 9(Fig. 9)
 | 图 9 胶结后试件与原尾砂的XRD图谱对比Fig.9 Comparison of XRD patterns between the cemented specimen and the original tailings |
图 10(Fig. 10)
 | 图 10 不同区域碳酸钙的质量分数Fig.10 wCaCO3 in different regions |
4 结论1) 利用兼性厌氧菌(反硝化卡斯特兰尼氏菌)MICP技术在密封养护条件下可以将尾砂胶结成有一定强度的试件，兼性厌氧菌MICP技术具备在缺氧或无氧环境下胶结尾砂再造充填体的潜力.
2) 胶结后的尾砂试件的力学性质随菌液浓度的增加，不断升高后趋近于平缓；随胶结溶液浓度和温度的升高，力学强度均先升高后降低；尾砂粒径越小，胶结效果越差，不同粒径尾砂混合后的试件胶结效果最好.
3) 经过兼性厌氧菌(反硝化卡斯特兰尼氏菌)MICP技术在密封养护条件下胶结后的尾砂试件中生成了碳酸钙沉淀，并多以方解石的形式存在，生成碳酸钙越多的部分力学性质越强，反之越弱；试件不同区域的碳酸钙生成量不同，其中试件内部碳酸钙生成量最多，侧壁碳酸钙生成量最少.
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