王凡, 胡筱敏, 李雪洁, 张博
东北大学 资源与土木工程学院, 辽宁 沈阳 110819
收稿日期：2021-08-17
基金项目：国家自然科学基金资助项目(51678118)。
作者简介：王凡(1991-)，男，辽宁沈阳人，东北大学博士研究生;
胡筱敏(1958-)，男，江西婺源人，东北大学教授，博士生导师。

摘要：将脉冲电场技术应用于硝酸盐废水的好氧反硝化处理.通过比较不同脉冲电场强度、脉冲频率、极板间距和接种量等因素作用下好氧反硝化细菌生长代谢的变化情况, 确定了脉冲电场处理的最佳工艺参数.结果表明, 在电场强度为0.8 V · cm^-1, 频率为1 000 Hz, 极板间距为5 cm, 接种量为5 % 的最佳试验条件下, 经脉冲电场处理的好氧反硝化细菌Pseudomonas putida W207-14仅24 h其在600 nm波长下的细胞光密度(OD600)、化学需氧量(COD)和硝态氮(NO₃^--N)的去除率均达到最大值, 分别为1.926±0.04, (97.67±1.12) % 和(90.34±0.73) %.与未处理的好氧反硝化细菌相比, 在生长时间大幅缩短的同时, 其硝酸盐去除速率提高了115.76 %.
关键词：脉冲电场好氧反硝化细菌生长代谢硝酸盐去除速率强化
Effect of Pulsed Electric Field on Growth Metabolism of Aerobic Denitrifiers
WANG Fan, HU Xiao-min, LI Xue-jie, ZHANG Bo
School of Resources & Civil Engineering, Northeastern University, Shenyang 110819, China
Corresponding author: HU Xiao-min, E-mail: hxmin_jj@163.com.

Abstract: Pulsed electric field(PEF)technology was applied to aerobic denitrification treatment of nitrate wastewater. By comparing the changes of growth metabolism of aerobic denitrifiers under different PEF strength, frequency, electrode distance and inoculation volume, the optimal process parameters of PEF treatment were determined. The results indicated that under the conditions of PEF strength 0.8 V · cm^-1, frequency 1 000 Hz, electrode distance 5 cm and inoculation volume 5 %, the optical density at 600 nm wavelengths (OD600), removal efficiency of COD and NO₃^--N of aerobic denitrifiers Pseudomonas putida W207-14 treated with PEF can reach the maximum value in 24 h, which were 1.926±0.04, (97.67±1.12) % and(90.34±0.73) %, respectively. Compared with the untreated aerobic denitrifiers, the growth time of the treated aerobic denitrifiers is significantly reduced, and the nitrate removal rate is increased by 115.76 %.
Key words: pulsed electric field(PEF)aerobic denitrifiersgrowth metabolismnitrate removal rateenhancement
硝酸盐是各行业产生的含氮废水中氮污染物的主要存在形式之一.近年来, 由于过量的硝酸盐对人类和生态环境造成的不利影响, 硝酸盐污染已成为一个全球性的环境问题, 世界各国对硝酸盐废水的排放实施了更为严格的监管^[1].同时, 研究人员也致力于开发经济高效的硝酸盐废水处理方法, 以减少硝酸盐污染带来的潜在危害^[2-3].好氧反硝化是一种新型的硝酸盐去除技术, 好氧反硝化菌的发现颠覆了传统反硝化只能在厌氧或缺氧条件下进行的理论.与传统生物反硝化不同, 好氧反硝化菌能够在有氧条件下同时利用氧气和硝酸盐作为电子受体进行反硝化, 这使硝化和反硝化过程得以在一个反应器内完成, 有效降低了处理成本和操作复杂性^[4].近年来, 好氧反硝化技术基于其独特的优势逐渐成为硝酸盐废水去除领域的研究热点, 研究人员针对好氧反硝化菌的筛选分离、生长因子的影响、关键酶和功能基因的表达等方面开展了一系列系统的研究^[5].然而, 在好氧反硝化研究取得诸多进展的同时, 也暴露出一些问题.目前报道的好氧反硝化技术的应用通常是采用向废水或活性污泥中直接投加一定比例好氧反硝化菌的方式进行的.但在实际处理过程中, 由于生长条件的制约以及微生物种群之间的竞争, 好氧反硝化菌的生长受到限制, 繁殖能力下降, 往往难以成为优势菌群.同时, 在高浓度硝酸盐废水的处理过程中, 随着亚硝酸盐积累量的增加, 反硝化进程受到一定程度的抑制, 这直接导致了好氧反硝化菌生长时间的延长以及硝酸盐去除能力的下降, 难以满足高浓度硝酸盐废水处理的长期需求^[6].因此, 开发高效的好氧反硝化强化技术, 充分发挥其优势和潜力, 具有一定的研究意义和价值.
近年来, 耦合了生物法和电化学法优点的生物电化学强化技术受到越来越多研究者的关注.在低强度的电场作用下, 微生物的酶活性、营养物质利用率以及体系内污染物的降解能力均有不同程度的提升^[7].作者课题组一直致力于电场强化生物脱氮相关技术的开发, 并取得了一定的研究进展^[8].之前的研究已经证实, 采用周期换向电絮凝强化技术进行生物脱氮, 对硝化和反硝化过程均有显著的促进作用.机理研究表明, 电絮凝强化后脱氮性能的提升主要是微生物作用, 即电场更多地作用于系统内的微生物, 通过刺激微生物的生长代谢间接影响系统的脱氮性能^[9-10].使用周期换向直流电场在节约能耗的同时, 一定程度上减少了极板的钝化, 但因其试验装置较为复杂, 可操作性较低.与之相比, 脉冲电场因其周期性的通断电特性, 且操作简单、能耗低, 具有更明显的优势.
脉冲电场能够诱导微生物产生不同的应激反应^[11].根据施加的电场强度及其时间函数的不同, 脉冲电场会诱导微生物在细胞膜上产生跨膜电压, 细胞膜表面出现瞬时或永久性孔隙, 分别导致可逆或不可逆电穿孔现象的发生.当电场强度较高时, 微生物的细胞膜结构被破坏, 不可逆电穿孔的出现导致细胞内成分泄露, 微生物被灭活.基于这一作用原理, 脉冲电场被广泛应用于食品加工领域^[12], 例如果汁、奶制品等液体食品的非热巴氏杀菌以及蔬菜、肉类等固体食品的加工保鲜, 并逐渐从实验室研究向产业化阶段发展^[13-14].随着研究的深入, 研究人员发现脉冲电场对微生物的致死效应不再是一个“全有或全无”的过程^[15].当对微生物施加低强度的脉冲电场时, 由于细胞膜上可逆电穿孔的出现, 微生物可能处于亚致死状态, 在此状态下的微生物更容易受到刺激而不是被灭活^[16].近年来, 脉冲电场刺激微生物的研究主要集中在脉冲电场辅助发酵领域^[17].作者课题组之前的研究首次将脉冲电场应用于强化生物脱氮领域, 并取得了积极的成果^[18].研究结果表明, 脉冲电场能够有效提高厌氧氨氧化细菌活性, 缩短厌氧氨氧化反应的启动时间.研究证实, 脉冲电场对厌氧氨氧化过程的强化同样是基于电场作用下微生物自身生长速度和代谢能力的提升.
因此, 本研究以好氧反硝化技术的主体微生物——好氧反硝化细菌为主要研究对象, 探究了脉冲电场对好氧反硝化细菌生长代谢的影响.通过试验, 确定了脉冲电场强化好氧反硝化技术稳定运行的相关工艺参数, 为后续脉冲电场强化技术的实际应用提供理论支持.
1 材料与方法1.1 菌种来源本研究利用溴百里酚蓝(BTB)培养基, 从沈阳市老虎冲垃圾卫生填埋场产生的反渗透垃圾浓缩液及其生物膜处理单元剩余污泥中分离出15株具有好氧反硝化能力的菌株.经过复筛, 确定了一株生长代谢均为最高水平的好氧反硝化细菌W207-14.通过前期单因素试验及响应曲面法进行参数优化, 确定了菌株W207-14的最佳生长条件, 即在最佳碳源为琥珀酸钠, 碳氮质量比为15, 初始pH为7.2, 温度为30 ℃, 转速为160 r/min的条件下, 48 h内好氧反硝化细菌W207-14在600 nm波长下的最大细胞光密度(OD600)为1.896±0.02, 对应的最终化学需氧量(chemical oxygen demand, COD)和硝态氮(NO₃^--N)去除率分别为(97.16±0.61) % 和(83.81±0.36) %.好氧反硝化细菌W207-14为杆状的革兰氏阴性菌, 经鉴定为恶臭假单胞菌属(Pseudomonas putida), 故命名为Pseudomonas putida W207-14, 基因序列已提交至GenBank数据库, 登录号MZ723875.
1.2 试验用水本研究分别以琥珀酸钠为唯一碳源、硝酸钾为唯一氮源, 配制高浓度模拟硝酸盐废水作为试验用水, 其主要成分(质量浓度)为: KNO₃ 2.0 g · L^-1, C₄H₄Na₂O₄ 7.5 g · L^-1, K₂HPO₄ 1.0 g · L^-1, KH₂PO₄ 1.0 g · L^-1, MgSO₄ · 7H₂O 0.2 g · L^-1.微量元素为2.0 mL · L^-1, 调节初始pH至7.2, 并于121 ℃条件下高压灭菌20 min后备用.
1.3 脉冲电场处理系统脉冲电场处理系统试验装置如图 1所示.脉冲电场处理室由有机玻璃制成, 有效容积为200 mL, 处理室内放置一对石墨电极.将经活化后处于对数生长期的好氧反硝化细菌Pseudomonas putida W207-14以一定接种量(体积分数)投加至处理室内, 在初始pH为7.2, 温度为30 ℃, 转速为160 r/min的条件下, 使用提供方波脉冲的脉冲电源进行脉冲电场处理研究.试验过程中, 对温度、pH和电导率等指标进行实时在线监测.
图 1(Fig. 1)

图 1 脉冲电场处理系统示意图Fig.1 Schematic diagram of pulsed electric field treatment system

1.4 分析方法本研究分别以OD600及COD, NO₃^--N和亚硝态氮(NO₂^--N)的去除情况作为好氧反硝化细菌生长代谢的评价指标^[19-20].所有的评价指标均采用国标法测定, 每个样品重复测定3次, 计算平均值和标准差, 数据具有统计学意义.
2 结果与讨论2.1 脉冲电场强度对好氧反硝化细菌生长代谢的影响本研究在初始pH为7.2, 温度为30 ℃, 转速为160 r/min, 脉冲频率为1 000 Hz, 极板间距为6 cm, 接种量为7.5 % 的试验条件下, 探究了不同脉冲电场强度下好氧反硝化细菌Pseudomonas putida W207-14生长代谢的变化情况, 试验结果如图 2所示.
图 2(Fig. 2)

图 2 脉冲电场强度对Pseudomonas putida W207-14生长代谢的影响Fig.2 Effect of PEF strength on growth metabolism of Pseudomonas putida W207-14

由图 2可知, 在电场强度分别为0.2, 0.4, 0.6, 0.8和1.0 V · cm^-1的条件下, 24 h内经脉冲电场处理的好氧反硝化细菌Pseudomonas putida W207-14的OD600分别为1.566±0.02, 1.691±0.02, 1.779±0.02, 1.878±0.03和1.818±0.02；COD去除率分别为(92.91±0.26) %, (94.64±0.16) %, (96.38±0.36) %, (97.16±0.61) % 和(96.92±0.66) %；NO₃^--N去除率分别为(70.15±1.17) %, (77.52±0.84) %, (82.85±2.00) %, (88.65±1.71) % 和(85.02±2.75) %.试验结果表明, 不同电场强度对好氧反硝化细菌的生长和氮代谢影响较大, 对碳代谢影响较小.在电场强度从0.2 V · cm^-1增加到0.8 V · cm^-1的过程中, 随着电场强度的增加, 更多的电荷在细胞膜表面积累, 导致好氧反硝化细菌细胞膜通透性发生改变, 促进了其对营养物质的吸收^[11], 这也从OD600和污染物去除率的逐渐提高体现出来.其中在电场强度为0.8 V · cm^-1时, 好氧反硝化细菌的OD600、COD和NO₃^--N的去除率均达到最大值, 分别为1.878±0.03, (97.16±0.61) % 和(88.65±1.71) %.当继续增加电场强度到1.0 V · cm^-1时, 由于较高的电场强度可能导致细胞膜上跨膜电压超过临界值, 部分可逆电穿孔转变为不可逆电穿孔, 伴随着一部分细胞的失活, 好氧反硝化细菌的生长代谢受到抑制, 其OD600和污染物去除率均有较小幅度的下降.因此, 对于好氧反硝化细菌Pseudomonas putida W207-14, 选取0.8 V · cm^-1的电场强度进行脉冲电场处理较为合适.
2.2 脉冲频率对好氧反硝化细菌生长代谢的影响本研究在初始pH为7.2, 温度为30 ℃, 转速为160 r/min, 脉冲电场强度为0.8 V · cm^-1, 极板间距为6 cm, 接种量为7.5 % 的试验条件下, 探究了不同脉冲频率下好氧反硝化细菌Pseudomonas putida W207-14生长代谢的变化情况, 试验结果如表 1所示.
表 1(Table 1)

表 1 脉冲频率对Pseudomonas putida W207-14生长代谢的影响Table 1 Effect of pulsed frequency on growth metabolism of Pseudomonas putida W207-14 评价指标 脉冲频率/Hz 100 500 1 000 1 500 2 000 OD600 1.240±0.01 1.524±0.01 1.917±0.01 1.812±0.01 1.721±0.02 COD去除率/% 77.77±0.53 95.80±0.26 96.96±0.31 95.43±0.10 91.99±0.31 NO3--N去除率/% 65.07±1.37 74.74±1.58 87.80±0.96 84.17±0.96 81.15±3.02

表 1 脉冲频率对Pseudomonas putida W207-14生长代谢的影响 Table 1 Effect of pulsed frequency on growth metabolism of Pseudomonas putida W207-14

由表 1可知, 不同脉冲频率对好氧反硝化细菌的生长代谢影响显著.在频率为100 Hz的低频条件下, 好氧反硝化细菌的生长代谢受到抑制, 其OD600和污染物去除率均处于较低水平.随着脉冲频率增加到1 000 Hz过程中, 好氧反硝化细菌的生长速度逐渐加快, 污染物去除率逐步提高.其中在脉冲频率为1 000 Hz时, 好氧反硝化细菌的OD600、COD和NO₃^--N的去除率均达到最大值, 分别为1.917±0.01, (96.96±0.31) % 和(87.80±0.96) %.随后继续增加脉冲频率到2 000 Hz, 好氧反硝化细菌的生长代谢再次受到抑制, 其OD600和污染物去除率呈逐渐下降趋势.研究表明, 低频有利于电荷在细胞膜上的积累, 从而引起细胞膜通透性的变化^[12].然而对于细胞壁较薄的革兰氏阴性菌, 过低的脉冲频率可能诱导细胞膜表面出现不可逆电穿孔, 系统内因一部分细胞失活而导致存活细胞数量减少, 低频下好氧反硝化细菌较低的OD600也验证了这一观点.相反, 过高的脉冲频率不利于电荷在细胞膜上积累, 可能导致细胞膜上可逆电穿孔数量的减少, 进而影响细胞对营养物质的吸收, 故好氧反硝化细菌的生长代谢受到一定程度的抑制.因此, 对于好氧反硝化细菌Pseudomonas putida W207-14, 选取1 000 Hz的脉冲频率进行脉冲电场处理较为合适.
2.3 极板间距对好氧反硝化细菌生长代谢的影响本研究在初始pH为7.2, 温度为30 ℃, 转速为160 r/min, 脉冲电场强度为0.8 V · cm^-1, 脉冲频率为1 000 Hz, 接种量为7.5 % 的试验条件下, 探究了不同极板间距下好氧反硝化细菌Pseudomonas putida W207-14生长代谢的变化情况, 试验结果如图 3所示.
图 3(Fig. 3)

图 3 极板间距对Pseudomonas putida W207-14生长代谢的影响Fig.3 Effect of electrode distance on growth metabolism of Pseudomonas putida W207-14

由图 3可知, 在极板间距分别为2, 3, 4, 5和6 cm的条件下, 24 h内经脉冲电场处理的好氧反硝化细菌Pseudomonas putida W207-14的OD600分别为1.581±0.01, 1.691±0.01, 1.800± 0.01, 1.907±0.01和1.889±0.02；COD去除率分别为(92.87±0.44) %, (94.51±0.80) %, (95.39±1.23) %, (96.96±0.31) % 和(95.15±0.72) %；NO₃^--N去除率分别为(80.42±1.17) %, (82.85±1.11) %, (85.14±0.76) %, (87.80±0.96) % 和(84.78±0.91) %.试验结果表明, 与其他参数相比, 不同极板间距对好氧反硝化细菌的生长代谢影响较小.随着极板间距的增加, 好氧反硝化细菌的OD600和污染物去除率均呈先增大后减小的趋势.其中在极板间距为5 cm时, 好氧反硝化细菌的OD600、COD和NO₃^--N的去除率均达到最大值, 分别为1.907±0.01, (96.96±0.31) % 和(87.80±0.96) %.随后继续增加极板间距到6 cm时, 好氧反硝化细菌的生长代谢受到抑制, 其OD600和污染物去除率均有较小幅度的下降.脉冲电场体系内电阻的大小随着极板间距的变化而改变.当极板间距较小时, 体系内电阻较小, 在电压恒定的情况下, 电流密度增大可能导致溶液出现浓差极化现象, 同时较小的极板间距使体系内受脉冲电场直接作用的好氧反硝化细菌数量较少, 故好氧反硝化细菌的OD600和污染物去除率相对较低.随着极板间距逐渐增大, 溶液中浓差极化现象减弱, 传质效果得到提升, 促进了好氧反硝化细菌对营养物质的吸收, 故其OD600和污染物去除率均有提高.当极板间距过大时, 体系内电阻较大, 在电压恒定的情况下, 电流密度减小, 好氧反硝化细菌对营养物质的吸收速度减缓, 故其生长代谢受到一定程度的抑制.因此, 对于好氧反硝化细菌Pseudomonas putida W207-14, 选取5 cm的极板间距进行脉冲电场处理较为合适.
2.4 接种量对好氧反硝化细菌生长代谢的影响本研究在初始pH为7.2, 温度为30 ℃, 转速为160 r/min, 脉冲电场强度为0.8 V · cm^-1, 脉冲频率为1 000 Hz, 极板间距为5 cm的试验条件下, 探究了不同接种量下好氧反硝化细菌Pseudomonas putida W207-14生长代谢的变化情况, 试验结果如表 2所示.
表 2(Table 2)

表 2 接种量对Pseudomonas putida W207-14生长代谢的影响Table 2 Effect of inoculation volume on growth metabolism of Pseudomonas putida W207-14 评价指标 接种量/% 0 1.0 2.5 5.0 7.5 OD600 0 1.643±0.02 1.820±0.01 1.893±0.02 1.910±0.02 COD去除率/% 18.46±5.52 92.54±0.12 94.24±0.33 96.58±0.16 97.03±0.41 NO3--N去除率/% 28.92±2.00 82.60±1.86 84.66±2.22 88.04±1.27 88.65±2.00

表 2 接种量对Pseudomonas putida W207-14生长代谢的影响 Table 2 Effect of inoculation volume on growth metabolism of Pseudomonas putida W207-14

由表 2可知, 当接种量为0时, 体系内没有好氧反硝化细菌, 故不存在生物反硝化作用, 仅发生电化学反应, 体系内的污染物去除率较低.当向体系内投加好氧反硝化细菌后, 随着接种量的增加, 体系内好氧反硝化细菌的OD600和污染物去除率逐步提高.当接种量为5.0 % 时, 好氧反硝化细菌的OD600、COD和NO₃^--N的去除率均达到较高水平, 分别为1.893±0.02, (96.58±0.16) % 和(88.04±1.27) %.随后继续增加接种量, 仅有助于好氧反硝化细菌在生长过程中能够更早进入对数生长期, 而对其最终的OD600和污染物去除率提升有限.因此综合考虑, 对于好氧反硝化细菌Pseudomonas putida W207-14, 选取5 % 的接种量进行脉冲电场处理较为合适.
2.5 脉冲电场作用下好氧反硝化细菌的生长代谢过程本研究在初始pH为7.2, 温度为30 ℃, 转速为160 r/min, 脉冲电场强度为0.8 V · cm^-1, 脉冲频率为1 000 Hz, 极板间距为5 cm, 接种量为5 % 的最佳试验条件下, 以OD600及COD，NO₃^--N和NO₂^--N的去除情况作为评价指标, 并与未经脉冲电场处理的好氧反硝化细菌进行对比, 探究了脉冲电场作用下好氧反硝化细菌Pseudomonas putida W207-14的生长代谢过程, 试验结果如图 4和图 5所示.
图 4(Fig. 4)

图 4 PEF作用下Pseudomonas putida W207-14的生长和碳代谢过程Fig.4 Growth and carbon metabolism of Pseudomonas putida W207-14 treated with PEF

图 5(Fig. 5)

图 5 PEF作用下Pseudomonas putida W207-14的氮代谢过程Fig.5 Nitrogen metabolism of Pseudomonas putida W207-14 treated with PEF

由图 4和图 5可知, 未经脉冲电场处理的好氧反硝化细菌在0~8 h内处于生长迟缓期, 8 h后进入对数生长期, 24 h后进入稳定生长期, 并在培养48 h时OD600达到最大值1.896±0.02, COD和NO₃-N质量浓度分别降低至(85.15±1.84)和(32.38±0.73) mg/L，对应的最终去除率分别为(97.16±0.61) % 和(83.81±0.36) %, 其硝酸盐去除速率为3.49 mg · L^-1 · h^-1.与之相比, 脉冲电场对好氧反硝化细菌的生长代谢有显著的刺激作用.经脉冲电场处理的好氧反硝化细菌在3 h后迅速进入对数生长期, 与未处理的好氧反硝化细菌相比对数期提前了5 h.在对数期的快速生长过程中, 其OD600、COD和NO₃^--N的去除率均明显高于相同生长时间下未处理的好氧反硝化细菌.经脉冲电场处理的好氧反硝化细菌在18 h后进入稳定生长期, 并在24 h时OD600达到最大值1.926±0.04, COD和NO₃-N质量浓度分别降低至(69.85±3.37)和(19.32±1.45) mg/L，对应的最终去除率分别为(97.67±1.12) % 和(90.34±0.73) %, 其硝酸盐去除速率为7.53 mg · L^-1 · h^-1.在好氧反硝化细菌的生长过程中, NO₂^--N的质量浓度均在1 mg · L^-1以下, 没有出现明显的亚硝酸盐积累现象.试验结果表明, 与未处理的好氧反硝化细菌相比, 经脉冲电场处理的好氧反硝化细菌Pseudomonas putida W207-14在生长时间大幅缩短的同时, 其硝酸盐去除速率提高了115.76 %.脉冲电场可以作为一种强化好氧反硝化细菌生长代谢的技术手段.
3 结论1) 本研究确定了脉冲电场强化好氧反硝化技术的最佳工艺参数.当初始pH为7.2, 温度为30 ℃, 转速为160 r/min, 脉冲电场强度为0.8 V · cm^-1, 脉冲频率为1 000 Hz, 极板间距为5 cm, 接种量为5 % 时, 24 h内好氧反硝化细菌Pseudomonas putida W207-14的最大OD600为1.926±0.04, 对应的最终COD和NO₃^--N去除率分别为(97.67±1.12) % 和(90.34±0.73) %.
2) 脉冲电场对好氧反硝化细菌Pseudomonas putida W207-14的生长有显著的刺激作用.经脉冲电场处理的好氧反硝化细菌仅24 h其OD600即可达到最大值, 与未处理的好氧反硝化细菌相比, 生长时间大幅缩短.
3) 脉冲电场对好氧反硝化细菌Pseudomonas putida W207-14的硝酸盐去除速率提升显著.经脉冲电场处理的好氧反硝化细菌的硝酸盐去除速率为7.53 mg · L^-1 · h^-1, 与未处理的好氧反硝化细菌相比, 其硝酸盐去除速率提高了115.76 %.
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