马月萍, 胡静
东北大学 生命科学与健康学院, 辽宁 沈阳 110169
收稿日期：2020-05-11
基金项目：国家自然科学基金资助项目(31872710, 31470699)。
作者简介：马月萍(1973-), 女, 宁夏吴忠人, 东北大学副教授, 博士。

摘要：SOC1基因是整合各种成花途径信号, 启动植物成花转变的关键基因之一.以木茼蒿为材料, 利用RT-PCR技术, 克隆了木茼蒿SOC1同源基因AfSOC1;利用qRT_PCR技术, 对其时空表达模式进行了分析.结果表明: 木茼蒿AfSOC1 cDNA长为648 bp, 编码216个氨基酸, 与拟南芥SOC1和金鱼草DEFH68的同源性分别为63.1 % 和62.1 %.该蛋白含有典型的MADS-box, K-box和SOC1转录因子特异性识别序列DVETELFIGP.AfSOC1在木茼蒿的根、茎、叶、花芽及花中均有表达, 在叶中和花芽中高表达.在系统进化树中AfSOC1与所有菊科植物SOC1聚在一起.该研究为了解木茼蒿的成花机制及通过分子生物学技术进行木茼蒿的遗传改良提供了理论基础.
关键词：木茼蒿SOC1同源基因实时定量PCR克隆分子系统
Cloning and Expression Analysis of SOC1 Homologue Gene in Argyranthemum Frutescens
MA Yue-ping, HU Jing
College of Life and Health Science, Northeastern University, Shenyang 110169, China
Corresponding author: MA Yue-ping, E-mail: mypluna@sina.com.

Abstract: SOC1 is one of crucial genes in integrating several pathway signals to initiate the transition of flowering. The SOC1 homologue gene AfSOC1 was identified and cloned from Argyranthemum frutescens using RT-PCR and its expression patterns were characterized using qRT-PCR. The results show that AfSOC1 gene consists of a 648-bp open reading frame and encodes a putative protein of 216 amino acids, which is 63.1 % identical to SOC1 in Arabidopsis and 62.1 % to DEFH68 in Antirrhinum. The putative protein sequences have a typical MADS-box, K-box domain and typical SOC1 motif DVETELFIGP. AfSOC1 was expressed at highly levels in leaves and flower bud. Its expression signals were also detected in shoot, stems, and flowers. Phylogenetic analysis showed that AfSOC1 was most closely related to dicotyledon SOC1-like than to monocotyledon. These results laid a foundation for us to understand the mechanism of AfSOC1 in regulation flowering.
Key words: Argyranthemum frutescensSOC1 homologue geneqRT-PCRcloningmolecular
成花是植物至关重要的生理过程, 不仅与物种的延续有着密切的联系, 而且与人类的生活息息相关.植物成花是一个复杂的过程, 受内外环境信号影响和多个成花途径调控.通过模式植物拟南芥、金鱼草等模式植物的研究表明, 植物开花受复杂的遗传网络调控, 主要包括光周期、低温春化、自主控制和赤霉素四种成花途径^[1-4].FLOWERING LOCUS T (FT), APETALA1 (AP1), SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1 (SOC1) 和LEAFY (LFY) 等基因能够整合来自这些成花途径的信号, 促进植物从营养生长转向生殖生长, 从而诱导开花^{[1, 4-6]}.
SOC1基因属于MADS-box家族成员之一.其编码的MADS-box蛋白, 具有典型的MIKS类MADS-box家族的结构特征^[7], 广泛存在于单子叶和双子叶植物中.研究表明, SOC1是一多功能蛋白, 不仅决定着花分生组织的转变及调节植物开花时间, 而且调节花器官的发育^[8-9].在不同植物中, SOC1基因的表达不同.拟南芥中SOC1在叶片和顶端生长点中表达^{[8, 10-11]}; 桉树中SOC1同源基因ETL在营养和生殖器官中均有表达, 在根部、芽部和器官原基中表达明显^[12]; 美洲山杨的SOC1同源基因PTM5在维管组织中有特异表达^[13]; 牡丹SOC1基因在花芽中的表达量最高, 根、茎、叶中表达量较低^[14]; 过量表达矮牵牛SOC1同源基因UNSHAVEN(UNS)使矮牵牛提前开花, 引起花器官上形成异位毛状体, 并使花瓣叶片化^[15]; 非洲菊中过量表达Gh-SOC1, 会引起花瓣变短^[16].这些结果表明SOC1基因的功能可能发生了明显的分化, 因此, 不同植物中分离更多的SOC1基因对于进一步了解SOC1基因的功能及分化具有重要意义.
木茼蒿(Argyranthemum frutescens)属于菊科茼蒿属植物, 因其花期较长, 枝叶繁茂, 花色清新淡雅而受到各国人民的喜爱, 广泛用于园林栽培中^[17].但关于其成花机制的研究少见报道.本研究利用RT-PCR技术克隆了木茼蒿SOC1同源基因全长cDNA序列, 分析了其序列特征, 并利用实时荧光定量PCR技术分析了其在不同组织中的表达模式, 为从分子水平上了解木茼蒿的成花机理提供理论基础, 也为利用基因工程技术进行木茼蒿的遗传改良提供遗传基础.
1 材料和方法1.1 材料木茼蒿菊引种自湖北神农架, 栽种于东北大学浑南校区植物资源圃.不同组织的材料在液氮中速冻后, 存放于-80 ℃冰箱.利用植物RNA提取试剂盒(Omega, USA)获取总RNA, 并用DNase Ⅰ (Omega, USA)去除残余的基因组DNA, 用琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop检测提取的RNA的浓度和质量.
1.2 方法1.2.1 SOC1基因的克隆以提取的RNA为模板, 利用RNA反转录试剂盒(Thermo, USA)将叶片和花芽混合样品提取的RNA反转录为cDNA; 根据已知植物SOC1同源基因设计了一对引物, 上游引物为ATGGTGAGAGGGAAGACTCA, 下游引物为GAACAATTCTGTTTCCACATC.以反转的cDNA为模板, PCR扩增木茼蒿SOC1同源基因5'端片段.根据获取的序列设计特异性引物AGCATGAAACTGCTGTCATG, 以用加了接头的oligo(dT)反转的cDNA为模板, 进行3'末端扩增.根据获取的两端序列设计特异性引物获取SOC1全长cDNA.PCR在20微升的体系中进行, 包括1.5 μL的cDNA, 0.3 μL的Taq polymerase (TaKaRa), 2.5 μL的10 ×Buffer, 2.0 μL的dNTPs, 上下游引物各1.0 μL, 16.7 μL的双蒸水.PCR反应条件为95 ℃预变性5 min后; 按95℃变性30 s, 53℃退火30s, 72℃延伸1 min, 进行30个循环; 72℃延伸10 min, 1 % 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物.将扩增出来的目标条带按照pCR-XL-TOPO的说明进行凝胶回收纯化后克隆于pCR-XL-TOPO vector载体上, 转化入感受态大肠杆菌后, 在含有Amp的培养基上培养过夜.通过限制性内切酶酶切质粒和巢式PCR进行单克隆鉴定, 挑选8个阳性克隆送至北京中美泰和公司测序.
1.2.2 生物信息学分析将获得的序列在GenBank进行blast比对, Conserved Domain Architecture Retrieval Tool在线分析蛋白结构; 从GenBank数据库中获得其他SOC1同源基因氨基酸序列, 利用MEGA7.0软件进行氨基酸序列比对, NJ法构建系统发育树.
1.2.3 qRT-PCR分析分别提取木茼蒿根、茎、叶、花芽和花(完全开放)总RNA, 将1μg RNA利用反转录试剂盒(Thermo, USA)反转为cDNA.利用Primer Express 3.0设计了用于qRT-PCR分析的引物QSOC1 F TGCTACTAGTAGGCAAGTGA和QSOC1 R CTATATCGTTCGATAGTCTC, Actin作为内参, 引物序列ATCTGGCATCACACG TTTT ACAA和TCTCACGATTGGCTTTT GGAT.实时定量PCR反应体系为20 μL, 包含2.0 μL的1∶5稀释的cDNA, 1.0 μL的上下游引物, 10 μL of SYBR GreenMaster Mix (Applied Biosystems), 6.0 μL的双蒸水.qPCR反应程序是55 ℃, 2 min; 95 ℃, 2 min; 然后95 ℃, 15 s; 60 ℃, 1 min, 40个循环.反应在ABI 7500实时定量PCR仪上进行(Applied Biosystems).利用60 ~ 95 ℃溶解曲线确定产物的特异性.每一个样品设3个生物学重复, 采用2^-ΔΔCt法进行相对定量分析^[18].
2 结果AfSOC1基因编码的蛋白质保守结构域如图 1所示.NCBI数据库检索结果表明, 克隆得到的序列含有一完整、长为648bp的编码框, 编码216个氨基酸, 属于MADS-box Superfamily, 含有保守的MADS-box和K-box结构域.对序列推测的氨基酸序列的结构进一步分析发现, 该蛋白序列中还含有SOC1转录因子特性识别序列DVETELFIGP.
图 1(Fig. 1)

图 1 AfSOC1蛋白质保守结构域Fig.1 Protein conserved regions of AfSOC1

AfSOC1基因的cDNA序列及编码的氨基酸序如图 2所示, 与拟南芥、金鱼草和菊花等等植物SOC1同源蛋白序列的相似性分别为63.1 %, 62.1 % 和94.9 %, 表明获取了木茼蒿SOC1同源基因, 将其命名为AfSOC1(GenBank登录号MT450472).
图 2(Fig. 2)

图 2 AfSOC1基因的cDNA序列及编码的氨基酸序Fig.2 cDNA sequence of AfSOC1 and the deduced amino acids 实线—MADS-box结构域; 波浪线—K-box结构域; 双实线—SOC1特性识别序列.

根据已知克隆的MADS基因的氨基酸序列, 构建了相关物种的系统进化树如图 3所示.木茼蒿AfSOC1蛋白与所有菊科植物的SOC1蛋白以100 % 的支持率聚在一起, 且距双子叶植物的距离近于单子叶植物.
图 3(Fig. 3)

图 3 木茼蒿SOC1同源蛋白和其他植物SOC1的系统进化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of SOC1 homologue of Argyranthemum frutescens and other plant SOC1 protein sequences OpSOC1—来自菊花(BAN19217.1); HaSOC1—来自向日葵(XP_022035850.1); LsSOC1—来自莴苣(XP_023764340.1); CcsSOC1—来自洋蓟(XP_024992577.1); FBP22—来自矮牵牛(AAK21253.1); SOC1—来自拟南芥(AAG16297.1); EgSOC1—来自桉树(AAP33085.1); SiSOC1—来自大岩桐(ABX90014.1); MdSOC1—来自苹果(ABI74449); ETL—来自桉树(AAD16052); TaMADS —来自小麦(BAF56968); LcSOC1—来自荔枝(AGS32267); ScSOC1—来自麻叶绣线菊(AEO20234.1); VvSOC1—来自葡萄(ACZ26527.1); PmSOC1—来自梅(AE020229);TabMAD1—来自烟草(CAA53782);PlmSOC1—来自车前草(CAJ38368.1); DEFH68—来自金鱼草(CAC86007); ZmMADS—来自玉米(NP_001105152.1.

qRT-PCR结果表明AfSOC1在木茼蒿的根、茎、叶、花芽和花中均有表达, 但在叶片和花芽中高表达, 如图 4所示.
图 4(Fig. 4)

图 4 木茼蒿AfSOC1基因在不同组织中的相对表达Fig.4 Relative expression of the AfSOC1 gene in different tissues of A. frutescens

3 讨论编码转录因子家族的MADS-box基因参与调控被子植物发育的各个阶段^[19].MADS-box转录因子均包含高度保守的MADS-box结构域、可变的K-box结构域和分化的C-末端^[20].MADS-box基因包含两大类群: 动物和真菌类MEF2-like基因及植物中的MIKC-type基因.MIKC-type基因又被分为AGL2-类、AGL6-类、AGL12-类、AGL15-类、AGL17-类、DEF-GLO-类、FLC-类、GGM13-类、SQUA-类、STMADS11-类和SOC1/TM3类, 共12个分支.本研究克隆了木茼蒿SOC1同源基因, 数据库搜索和系统进化分析表明其属于SOC1/TM3类, 将其命名为AfSOC1.其推测的氨基酸序列含有MADS-box结构域、K-box结构域和C-末端SOC1转录因子特性识别序列DVETELFIGP(图 1), 与其他植物的SOC1基因序列结构相似, 说明SOC1的结构在植物进化中是相对保守的^[21].
作为成花途径整合因子之一, SOC1同源基因已在非洲菊、牡丹、红掌、大岩桐、兰花、水仙等植物中获得^{[14, 16, 22, 23-27]}.SOC1同源基因在植物的不同组织中均有表达, 但在不同植物中高表达的部位不同.红掌中SOC1基因在营养器官和生殖器官中均有表达, 但在果实、叶片、茎和花梗中高表达^[23], 甘菊中ClSOC1在叶、茎尖、叶柄、茎和根中均有表达, 但在植物的茎尖和叶片高表达^[22]; 草莓FaSOC1在花芽、花雄蕊和萼片中高表达^[28]; 牡丹PsSOC1在营养器官和生殖器官中均有表达, 在花芽萌发期和败育花蕾中高表达^[14].金柑FcSOC1在茎叶、花芽、花蕾、花瓣、子房中均高表达^[29].水仙花中NtSOC1在花芽分化时高度表达^[27].木茼蒿AfSOC1在叶片和花芽中高表达, 表明其在叶片发育和成花转变中发挥重要作用.同时在木茼蒿的根、茎花中也有表达, 说明AfSOC1也参与了根、茎和花器官的发育, 与白桦中BpSOC1基因的表达结果一致^[30].这些研究表明SOC1基因编码的蛋白是一个多功能蛋白, 不同植物中SOC1基因表达上的变化也表明其在长期的进化过程中功能上可能发生了分化.
在根据SOC1蛋白绘制的系统进化树中, 同科或同属的植物都聚在一起.AfSOC1与菊花OpSOC1以100 % 的支持率聚在一个枝上, 与分类学中木茼蒿和菊属植物都属于菊科春黄菊族结果一致.这些结果表明SOC1蛋白在较高分类学水平研究中, 是一个有效的分子标记.
4 结论本文获得了木茼蒿SOC1同源基因AfSOC1, 该基因cDNA长为648 bp, 编码216个氨基酸, 含有典型的MADS-box, K-box和SOC1转录因子特异性识别序列DVETELFIGP.AfSOC1在木茼蒿的叶和花芽中高表达, 在根、茎、叶、花芽及完全开放的花中也有表达.
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