东北大学 资源与土木工程学院， 辽宁 沈阳 110819
收稿日期: 2015-03-26
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (51278090).
作者简介: 刘金亮(1984-),男,山东枣庄人,东北大学博士研究生; 胡筱敏(1958-),男,江西婺源人,东北大学教授，博士生导师.
摘要: 应用多相分类手段对絮凝菌株XHUA9进行了分类研究，并对分离提纯的发酵产物进行紫外和红外分析.基于16S rRNA基因序列的系统发育分析表明，该菌和模式菌株Paenibacillus hunanensis的序列同源性为96.7%，基因组DNA-DNA同源性杂交值为51.6%.菌株的主要极性脂肪酸为双磷脂酰甘油、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇.菌株优势醌为MK-7，主要优势脂肪酸为anteiso-C15:0和 C16:0.菌株(G+C)摩尔分数为51.9%.根据上述结果，菌株XHUA9鉴定为类芽孢杆菌属内的新种，命名为Paenibacillus shenyangensis sp. nov..紫外扫描和红外检测等结果表明，菌株XHUA9所产絮凝剂的主要成分为多糖类物质.
关键词: 絮凝剂类芽孢杆菌鉴定16S rRNA多相分类 Isolation and Identification of an Efficient Bioflocculant-Producing Strain
LIU Jin-liang, JIANG Bin-hui, ZHAO Xin, HU Xiao-min
School of Resources & Civil Engineering, Northeastern University, Shenyang 110819, China
Corresponding author: HU Xiao-min, professor, E-mail: hxmin_jj@163.com
Abstract: In order to ascertain taxonomic position of strain XHUA9, the polyphasic taxonomical identification was performed. The ferment products were separated and purified and then were analyzed by ultraviolet scanning spectrum (UV scanning spectrum) and infrared spectrum (IR spectrum). Phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequences showed that the strain belonged to the genus Paenibacillus, sharing a most closely sequence similarity of 96.7% and DNA-DNA hybridization value of 51.6% with the type strain Paenibacillus hunanensis. The major polar lipids were diphosphatidylglycerol, phosphatidylglycerol, phosphatidylethanolamine and phosphatidylinositol. The predominant menaquinone is MK-7 and the major cellular fatty acids were anteiso-C15:0 and C16:0. The genomic DNA G+C content was 51.9 mol%. Based on the results of the present study, it is concluded that strain XHUA9 represents a novel species of the genus Paenibacillus, for which the name Paenibacillus shenyangensis sp. nov. is proposed. The UV scanning and IR spectra data showed that bioflocculant produced by strain XHUA9 was mainly composed of polysaccharides.
Key words: flocculantPaenibacillusidentification16S rRNApolyphasic taxonomical 微生物絮凝剂(microbial flocculant，MBF)是具有絮凝活性的微生物代谢产物[1].它们一般由多糖、蛋白质、糖蛋白、核酸等高分子物质构成[2]，分子量一般大于1×105 Da.相对于无机絮凝剂和有机合成絮凝剂，微生物絮凝剂具有无毒、可生物降解及无二次污染等特点[3]，使其更适合应用在饮用水和污水处理[4, 5]、食品和发酵产业的下游工序中[6].研究发现能够产生絮凝剂的微生物种类繁多，包括细菌、放线菌、真菌、霉菌、酵母菌和某些藻类等.这些微生物资源丰富，广泛分布在土壤、沉积物、活性污泥及污水中.但存在生产成本较高、发酵工艺不成熟和絮凝效果不稳定等问题，限制了微生物絮凝剂的发展.因此，筛选高效稳定的絮凝剂产生菌，提高产品的稳定性是微生物絮凝剂的发展趋势之一.
类芽孢杆菌属最初是由Ash等基于16S rRNA基因序列将一些菌株从芽孢杆菌属中划分出来的[7].随后从土壤、植物的根和食物等不同的环境样品中分离出很多该属的菌株[8].由于该属的菌株具有固氮、降解纤维素和木聚糖、产生强抗菌化合物等功能[9, 10, 11]，类芽孢杆菌已成为近年来的研究热点.本研究从土壤中分离得到一株絮凝剂产生菌XHUA9，对菌株形态、生理生化特征、细胞化学组分、(G + C) 摩尔分数、基因组DNA-DNA同源性及16S rRNA基因序列等进行了研究.同时将菌株XHUA9的发酵产物进行分离提纯，并利用紫外和红外光谱检测其主要组成成分.
1 材料和方法1.1 菌株分离方法及培养条件XHUA9筛选自一棵桃树下的土壤样本，用牛肉膏蛋白胨培养基，采用稀释法分离.保存于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心(CGMCC NO.2040).实验中选取模式菌株Paenibacillus hunanensis FeL05T作为对照菌.筛选培养基组成为: 葡萄糖 1.0 g，KH2PO4 0.2 g，K2HPO4 0.5 g，酵母膏 0.5 g，脲 0.05 g，MgSO4·7H2O 0.02 g，NaCl 0.01 g，蒸馏水 100 mL,pH=7.0.在三角瓶中装入 100 mL培养基并灭菌，然后接入菌种，在 30 ℃和150 r/min的条件下培养30 h，测定培养液絮凝率.
1.2 主要试剂及仪器实验所用试剂均为分析纯.
主要仪器包括电子天平(FA1004，上海舜宇)、扫描电镜(SSX-550，岛津)、冷冻离心机(5424R，eppendorf)、PCR扩增仪(2720，美国ABI)、紫外分光光度计(759，上海菁华)、红外光谱仪(Nicolet 380,美国)、恒温振荡器(TS-100B，上海天呈)、高压灭菌锅(YXQ-LS-50SII，上海博迅)、超净工作台(SW-CJ-1FD，上海博迅)等.
1.3 絮凝率测定方法在100 mL高岭土悬浮液(5 g/L)中加入0.1 mL菌株培养液，空白对照中不加培养液，静置5 min后测定上清液光密度OD550.絮凝率计算公式为
E = (OD550-OD′550) / OD550 × 100%.
其中:OD550 为未加培养液前550 nm 处光密度值；OD′550为加入培养液5 min后550 nm 处光密度值.
1.4 发酵产物的分离鉴定将培养液稀释10倍，高速离心去除菌体，然后用旋转蒸发器浓缩(50～60 ℃)至原体积，加入2倍体积的预冷乙醇，离心收集沉淀，再将沉淀溶于水，加0.5倍氯仿和正丁醇混合液去除游离蛋白，然后将上清液透析，并用乙醇沉淀，最后真空冷冻干燥得到絮凝剂精品.分别用紫外扫描、蛋白特征反应、Molish和蒽酮呈色反应检测产物中是否含有蛋白质、核酸和糖类，并用红外光谱仪分析产物中的特征基团.
1.5 菌株形态及生理生化鉴定光学显微镜下观察菌体形态，扫描电子显微镜下观察菌体表面结构和有无内生孢子；采用革兰氏染色；利用API 50 CHB,API 20E (BioMerieux)试剂盒及GP2鉴定板(Biolog) (方法参照公司说明书)对菌株进行唯一碳源利用及酶学特性等生理生化指标鉴定.
1.6 菌株细胞化学组分分析脂肪酸组分分析使用美国MIDI公司的Sherolock全自动细菌鉴定系统(Sherolock Version 6.0)；极性脂肪酸通过二维薄层层析提取和分离，并喷洒检测试剂鉴定；细胞甲基萘醌采用Collins的方法分离提纯[12]，并用高效液相色谱分析法测定.
1.7 16S rRNA基因序列分析采用高效液相色谱法测定菌株(G + C) 摩尔分数；采用微孔板杂交法测定菌株和模式菌株间基因组DNA-DNA同源性；16S rRNA基因序列分析：扩增用上下游引物分别为BSF 8/27 (5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’)和BSR 1525/1541 (5’-AAG GAG GTG ATC CAG CC-3’).以菌株XHUA9的基因组为模板进行 PCR扩增.反应程序为94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，循环 35 次；72 ℃ 30 min.用TaKaRa公司回收试剂盒回收 PCR扩增产物，送生物公司测序.将测序得到的序列在NCBI的网站上进行比对，并用软件MEGA构建系统发育树[13].
2 结果与讨论2.1 形态学特征XHUA9菌株为长杆状(见图 1a)，(4.16~4.83)×0.83 μm，好氧，能形成芽孢，革兰氏染色阳性.菌株 30 ℃ 下平板培养，其菌落呈圆形、表面光滑，较黏，凸起很高，为浅黄棕色并透明 (见图 1b).
图1(Figure 1)
 | 图1 菌株XHUA9的细胞形态及菌落Fig. 1 Morphology and colony of the strain XHUA9(a)—细胞形态； (b)—菌落. |
2.2 生理生化特征菌株XHUA9和模式菌株FeL05T生理生化实验结果见表 1，表中YQ1是课题组筛选的另一株类芽孢杆菌.从表 1可以看出,菌株XHUA9和FeL05T主要生理生化指标较一致，个别指标上存在不同.
表1(Table 1)
 表1 XHUA9的生理生化实验结果Table 1 Physiological and biochemical characteristics of the strain XHUA9
| 表1 XHUA9的生理生化实验结果Table 1 Physiological and biochemical characteristics of the strain XHUA9 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2.3 菌株细胞化学组分菌株XHUA9主要脂肪酸为anteiso-C15:0,C16:0,iso-C15:0,anteiso-C17:0,iso-C16:0和iso-C17:0；菌株XHUA9主要极性脂肪酸为双磷脂酰甘油(DPG)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰肌醇(PI)，菌株XHUA9和FeL05T的极性脂肪酸检测结果见图 2；菌株XHUA9和FeL05T的甲基萘醌均为MK-7.
图2(Figure 2)
 | 图2 菌株XHUA9和FeL05T的极性脂肪酸检测结果Fig. 2 Polar lipid profile of strain XHUA9 and FeL05T |
不同微生物的脂肪酸在质量分数和组成上差异较大，它和微生物耐药性、遗传变异等关系密切[14].不同微生物具有不同种类的醌，它是微生物能量代谢过程中的电子传递体.微生物醌主要有两种类型：甲基萘醌(简写为MK，即2-甲基-3-多异戊烯基-1,4-萘醌)和泛醌(简写为Q，即2,3-二甲氧基-5-甲基-6多异戊烯基-l,4-苯醌).醌的异戊烯基侧链长度和氢的饱和度不同，可以为不同微生物属的分类提供依据.革兰氏阳性细菌主要合成甲基萘醌.经对比发现，菌株XHUA9和FeL05T的主要脂肪酸相同，质量分数相差不大；主要极性脂肪酸存在差异，菌株XHUA9和FeL05T均含有双磷脂酰甘油(DPG)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰肌醇(PI)，此外，FeL05T还含有氨基脂(AL)和磷脂(PL)；菌株XHUA9和FeL05T的甲基萘醌相同.
2.4 菌株(G+C)摩尔分数和DNA同源性分析微生物DNA碱基组成具有种特异性，DNA的(G+C)值在细胞中很稳定，可以作为细菌鉴定重要遗传指标，而且它不受菌龄及突变因素以外的其他因素影响.菌株XHUA9的(G + C) 摩尔分数为51.9%.
许多资料表明，DNA-DNA杂交最适合于微生物种一级水平的研究.DNA-DNA杂交同源性在低于20%的菌株为不同属的关系，同源性在60%以上者可视为同一个种，而同源性在20%~30%之间的菌株应为属内关系紧密的种.菌株XHUA9和模式菌株FeL05T间基因组DNA-DNA同源性杂交值为51.6%，这个值在30%~60%之间，说明菌株XHUA9和Paenibacillus hunanensis是类芽孢杆菌属内亲缘关系较近的种.
2.5 16S rRNA基因序列分析采用细菌通用引物对菌株XHUA9 的16S rRNA基因序列进行测序，得到目标序列长度为1 426 kb.其 16S rRNA基因序列的 GenBank登录号为KF834270.用得到的序列在 GenBank数据库中进行Blasten检索，结果表明菌株XHUA9与YQ1,Paenibacillus hunanensis FeL05T和Paenibacillus kribbensis AM49T序列同源性分别达到 99%，96.7%和94%.采用软件MEGA4.1中 Neighbor-joining法构建16S rRNA序列系统发育树，结果发现菌株XHUA9和课题组筛选的另一菌株YQ1聚为一簇 (见图 3)，表明它们的亲缘关系最近.
图3(Figure 3)
 | 图3 菌株XHUA9的系统发育树Fig. 3 Phylogenetic tree of strain XHUA9 |
2.6 菌株发酵产物的絮凝活性及成分分析经絮凝活性测定，菌株XHUA9所产絮凝剂处理高岭土悬浮液，絮凝率高达 97 %，用量少，且不需添加 Ca2+,Al3+等作为助凝剂.用蒸馏水溶解絮凝剂提纯产物，在200~400 nm波长下进行紫外扫描，得到的扫描图中没有出现蛋白质和核酸的吸收峰，说明提纯产物不含蛋白质和核酸.双缩脲反应、茚三酮反应和蛋白黄色反应都无颜色变化，进一步表明提纯产物中不含蛋白质.在Molish 反应中有紫环生成，而蒽酮反应呈现蓝绿色，说明产物中有糖的成分.
菌株XHUA9产生絮凝剂的红外光谱图具有典型的多糖特征吸收峰(见图 4).特征吸收峰为3 475.18，2 924.49，1 666.20，1 622.94，1 358.42，1 004.12 cm-1.3 475.18 cm-1处宽吸收峰是糖分子内或糖分子间的氢键O—H伸缩振动的结果；2 924.49 cm-1处小吸收峰为C—H不对称伸缩振动的结果，此区域的吸收峰是糖类的特征；1 666.20 cm-1处吸收峰是CO键伸缩振动偏移的结果；1 622.94 cm-1处吸收峰是CC键伸缩振动的结果；1 358.42 cm-1吸收峰是C—H的变角振动；1 000~1 200 cm-1间吸收峰是C—O伸缩振动.通过红外光谱分析，得出菌株XHUA9所产絮凝剂的主要成分为多糖类物质.
图4(Figure 4)
 | 图4 絮凝菌XHUA9产生絮凝剂的红外光谱图Fig. 4 Infrared ray spectrum of bioflocculant produced by XHUA9 |
3 结论1) 根据形态学特征、生理生化特征、细胞化学组分、分子生物学等多相分类鉴定结果，菌株XHUA9被鉴定为类芽孢杆菌属内的新种.
2) 菌株XHUA9所产絮凝剂不需添加 Ca2+，Al3+等作为助凝剂，且絮凝活性高、用量少，在微生物絮凝剂的开发和利用上具有一定的研究价值.
3) 紫外扫描、红外光谱、蛋白质和糖类的颜色反应等分析结果表明，菌株XHUA9所产絮凝剂的主要成分为多糖类物质.
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... 微生物絮凝剂(microbial flocculant，MBF)是具有絮凝活性的微生物代谢产物[1].它们一般由多糖、蛋白质、糖蛋白、核酸等高分子物质构成 ...
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