团队首先通过结构和序列分析预测，脑膜炎双球菌物种的AcrIIC1蛋白中可能存在氧化还原开关，并运用液体核磁共振及DNA体外酶切等生化实验，证实该开关的真实存在，并能调节AcrIIC1单体-二聚体的相互转化和对Cas9的抑制活性。团队进一步解析AcrIIC1在不同氧化还原状态下的结构，从空间位阻的角度解释氧化态AcrIIC1失活的分子机制，鉴定两个介导氧化还原过程的关键半胱氨酸，并提出AcrIIC1在不同氧化还原状态下如何通过影响Cas9亚基之间的相互作用，调控其活性的动态过程模型（图1）。团队进一步通过系统发育分析和生化实验，证实这两个半胱氨酸介导的氧化还原开关也存在于其他两个物种中，揭示了氧化还原调控可能是Anti-CRISPR蛋白普遍存在的调控机制。基于此，团队设计并成功获得AcrIIC1-SS突变体，其体外和细胞内实验结果表明，该突变体优于野生型AcrIIC1，并在各种氧化还原条件下可稳定地保持高活性（图2）。
AcrIIC1是广谱的CRIPSR-Cas9抑制剂、重要的抑制CRISPR脱靶效应的工具蛋白。该研究首次发现NmeAcrIIC1存在两个保守半胱氨酸介导的氧化还原开关。该开关通过调节AcrIIC1单体-二聚体的氧化还原循环，动态调控其对Cas9的抑制活性。该研究成果提示：在肿瘤细胞等高活性氧环境下应用Anti-CRISPR蛋白，需考虑细胞内局部氧化环境使其失活的可能性；运用Anti-CRISPR的氧化还原开关，可实现对Cas9蛋白更为动态及精细调控。基于新发现，团队进一步设计并获得在高活性氧细胞环境内具有高效抑制Cas9活性的AcrIIC1突变体蛋白。
杨帆副研究员为论文通讯作者。杨帆课题组研究助理赵雅楠，中国科学院上海有机化学研究所博士研究生胡姣姣，我校环境学院杨珊珊副研究员为论文共同第一作者。我校校友、西湖大学博士研究生仲憬为第二作者，为论文数个关键实验数据的采集作出重要贡献。生命学院博士研究生王硕、翟睿阳，硕士研究生江芳、张济显、许月，我校校友焦玉卓、任丙楠，生命学院丛华副教授、朱玉威副研究员、韩凤桐老师参与相关研究工作。生命学院黄志伟教授，中国科学院上海有机化学研究所刘建平副研究员、张胜男副研究员为论文提供大力支持。
该研究获得国家自然科学基金委、哈工大“世界顶尖大学战略合作计划”项目经费的支持。
论文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-34551-8
图1 AcrIIC1不同氧化还原状态如何影响Cas9活性的模式图
图2 wtAcrIIC1与AcrIIC1-SS抑制CRISPR-Cas9的活性比较示意图
责任编辑：梁英爽
