该论文首次通过实验证明了缩短spacer长度能够使SpCas9和eSpCas(1.1)表现出类似于nCas9(D10A)的切口酶活性，从机制方面解释了改变spacer的长度导致SpCas9和eSpCas9(1.1)核酸酶活性降低的原因。基于此发现，作者开发了由胞嘧啶脱氨酶(APOBE3A)、eSpCas9(1.1)与尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)融合而成的植物双功能基因组编辑系统。通常情况下，当spacer长度为20 nt时，双功能基因组编辑系统APOBE3A-eSpCas9(1.1)-UGI能在靶位点处产生Indels (insertion/deletion)突变；当spacer长度为19 nt时，APOBE3A-eSpCas9(1.1)-UGI表现出胞嘧啶(C)至胸腺嘧啶(T)的碱基编辑活性。因此，该系统可同时对多个靶位点分别实施不同类型的编辑，为基因功能研究和分子设计育种提供了新的工具。 来源于酿脓链球菌的SpCas9是研究最早应用最为广泛的CRISPR/Cas9系统。已有的研究表明缩短或者增加spacer的长度可以提高SpCas9的特异性，同时研究发现改变spacer的长度也会影响SpCas9及其大部分变体的核酸酶活性，但是其作用机制并不清楚。该文通过实验证明缩短spacer的长度会使SpCas9和eSpCas9(1.1)表现出类似于nCas9(D10A)的切口酶活性。
基于此机制，作者开发了由胞嘧啶脱氨酶(APOBE3A)、eSpCas9(1.1))与尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)融合而成的植物双功能基因组编辑系统。通过在水稻原生质中对9个内源基因位点进行测试，发现在大多数位点，当spacer长度为20 nt时，双功能基因组编辑系统APOBE3A-eSpCas9(1.1)-UGI主要造成indels突变；当spacer长度为19 nt时，该系统主要行使胞嘧啶(C)至胸腺嘧啶(T)的碱基替换的功能。
小麦乙酰乳酸合成酶基因 TaALS-P174位点的胞嘧啶替换为胸腺嘧啶可以使小麦产生对除草剂烟嘧磺隆的抗性。此突变作为小麦遗传转化及组织培养过程中的筛选标记，可以提高突变体筛选效率。为了高效获得TaGW2基因的敲除突变体，作者构建了分别靶向小麦TaALS和TaGW2基因的spacer长度为19 nt和20 nt的双sgRNAs表达载体，与APOBE3A-eSpCas9(1.1)-UGI载体共同转化小麦未成熟胚。在植物组织培养的过程中添加0.254 mg/L的烟嘧磺隆进行筛选，获得了8棵小麦再生植株，经检测这8棵植株中TaALS和TaGW2基因共编辑效率达到100%。
作物传统的杂交育种过程中，由于基因连锁导致一些优异等位变异难以聚合。植物双功能基因组编辑系统可以克服基因连锁的限制，快速的实现多种优良等位基因的聚合，加速作物基因功能研究和分子设计育种的进程。
该研究工作得到中国科学院战略性先导专项、国家重大科技专项、国家自然科学基金委的等项目资助。中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞研究员、张华伟副研究员以及农业资源研究中心张正斌研究员为共同通讯作者。农业资源研究中心博士生范荣和中国科学院遗传与发育生物学研究所直博生柴壮壮为共同第一作者。
论文链接：https://doi.org/10.1007/s11427-020-1722-0
