山西师范大学 生命科学学院，山西 临汾 041000
收稿日期：2019-05-15；接收日期：2019-07-25；网络出版时间：2019-08-06
基金项目：国家自然科学基金(No. 31771858)资助
摘要：马铃薯锌转运蛋白(Solanum tuberosum zinc transporter 11，StZnT11)对于维持细胞中锌稳态至关重要。通过研究StZnT11在非生物胁迫和生物胁迫下的表达情况，为验证马铃薯StZnT11在青枯菌生物胁迫过程中的作用奠定了基础。从前期工作获得的表达文库中得到EST序列，利用NCBI中的Blast工具，对原始序列进行同源性分析，选择与原始序列的相似度、覆盖度、e期望值最高的一条同源对象序列。通过电子克隆，得到StZnT11基因。采用生物信息学方法对StZnT11基因的基因序列及编码的氨基酸组成、理化性质、分子进化、磷酸化位点、高级结构等多角度进行分析。结果表明，该基因cDNA全长1 300 bp，编码348个氨基酸，编码蛋白含23个磷酸化位点，有1个信号肽，有9个跨膜区域，是定位在质膜上的疏水性蛋白。通过氨基酸序列比对，StZnT11蛋白与烟草、番茄和辣椒等植物中的锌转运蛋白同源性较高。实时荧光定量聚合酶链反应检测结果表明，StZnT11在不同浓度的外源植物激素脱落酸(ABA)的作用下上调。组织定位检测提示StZnT11主要表达于特定组织(茎维管系统的韧皮部和叶片维管束)。这些结果为进一步进行该基因的实验克隆及功能验证研究提供了理论依据。
关键词：马铃薯锌转运蛋白11生物信息学实时荧光定量PCR
In silico cloning, expression and bioinformatics analysis of StZnT11 in Solanum tuberosum
Ruimin Yu, Yannan Chang, Pengxiang Pang, Yanyun Suo, Gang Gao
College of Life Sciences, Shanxi Normal University, Linfen 041000, Shanxi, China
Received: May 15, 2019; Accepted: July 25, 2019; Published: August 6, 2019
Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31771858)
Corresponding author: Gang Gao. Tel: +86-357-2051197; E-mail: gaogang@sxnu.edu.cn.
Abstract: Solanum tuberosum Zinc transporter 11 (StZnT11) is very important for maintaining zinc homeostasis in cells. The study on the expression of StZnT11 under abiotic stress and biotic stress laid a foundation for verifying the role of potato StZnT11 in the process of biotic stress of Ralstonia solanacearum species complex. According to the designated EST sequence, the homology of the original sequence was analyzed by using the Blast tool in NCBI, and a homologous object sequence with the highest similarity, coverage and e expectation value was selected. StZnT11 gene is obtained by Silico Cloning. The sequence and coding amino acid composition, physicochemical properties, molecular evolution, phosphorylation site and advanced structure of Solanum tuberosum StZnT11 gene were analyzed by bioinformatics method. The results showed that the cDNA gene is 1 300 bp in length, encoding a protein containing 348 amino acid residues, including 23 phosphorylation sites, one signal peptide and nine transmembrane regions, and is a hydrophobic protein located on the plasma membrane. Through amino acid sequence alignment, StZnT11 protein has a high homology with zinc transporter from tobacco, tomato, pepper and other plants. The results of real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction showed that, StZnT11 is up-regulated by different concentrations of exogenous plant hormone abscisic acid (ABA). Tissue localization showed that StZnT11 was mainly expressed in specific tissues (phloem and leaf vascular bundles of stem vascular system). These results provide a theoretical basis for further experimental cloning and functional verification of the gene.
Keywords: potatozinc transporter 11bioinformaticsreal-time fluorescent quantitative PCR
锌是生物体中必需的微量元素，广泛参与各种生物过程。在酶催化、基因调控、大分子稳定性等方面发挥着尤为重要的作用。锌也是一种新兴的调节生理和病理事件的信号分子[1]。锌通过锌转运蛋白进入细胞。据估计，人类基因组编码的蛋白质中有10%是锌结合蛋白[2]。锌在行使细胞功能和调控高浓度的毒性方面都是必需的，因此严格控制锌稳态对细胞活力至关重要[3-4]。锌转运蛋白是跨膜蛋白，被称为阳离子转运促进剂，主要将锌转运到细胞外，或通过细胞内的储存细胞器积累多余的锌来控制细胞内锌的含量[5-6]。这些锌转运蛋白通过不透水的膜屏障运输Zn2+。据研究，锌转运蛋白有两个蛋白家族，SLC39 (也称为ZIP)和SLC30 (也称为ZnT)。ZIP家族和ZnT家族分别负责锌的流入和流出[7-9]，在相反方向起作用以维持细胞锌稳态[10]。这些转运体存在于生物膜上[11-13]。
锌转运蛋白在植物发育中发挥重要作用。在拟南芥Arabidopsis thaliana中，锌转运蛋白在根中表达以响应锌缺乏，比如ZIP1、ZIP3和ZIP4等锌转运蛋白。这些蛋白质负责植物中的锌摄取。过量表达锌转运蛋白还可以增加种子中锌的含量，从而增加谷物微量元素含量。拟南芥对ZIP蛋白家族的研究作出了重大贡献[8]。在水稻Oryza sativa L.中，OsZIP4的过表达导致水稻植株锌分布紊乱[14]。OsZIP5的表达对水稻中锌分布起重要作用[15]。在烟草Nicotiana tabacum中，将克隆的粗糙脉孢菌锌转运蛋白基因(Tzn1)引入烟草中，其表达增强了植物锌的积累[16]，并且研究发现含有Tzn1基因的转基因烟草植株具有较好的抗氧化能力。在小麦Triticum aestivum L.中，TdZIP1 (ZIP1转运体)通过转运Zn2+可以改善小麦缺锌耐受性[17]。在苜蓿Medicago Sativa Linn中，MtZIP2在根和茎中表达，并且通过Zn2+施肥上调[18]。综上所述，锌转运蛋白在植物细胞中对锌稳态的调节至关重要。研究发现，锌在细胞内信号通路中也起重要作用[19]。锌被认为是一种重要的信号分子，在正常细胞生理和病理生理学中发挥作用。正常情况下，锌被证明可以调节几种磷酸化依赖的信号级联反应，包括MAPKs和Akt，在细胞发育、增殖和死亡中发挥着重要作用。锌信号是由细胞内锌稳态控制的，而锌稳态又受到锌转运蛋白的调控，特别是ZIP和ZnT两个锌转运蛋白家族。因此，对于锌转运蛋白的研究是非常必要的。植物激素ABA在非生物胁迫反应中发挥重要的作用，特别是在干旱和盐碱胁迫中[20]，并且ABA被认为是植物免疫的重要参与者[21]。Audenaert等证明在番茄中ABA对灰霉病的免疫力有负面影响。这在拟南芥中也得到了支持，在拟南芥中ABA生物合成突变体aba2-12和aao3-2对灰霉病杆菌也表现出增强的抗性[22]。然而，关于马铃薯StZnT11的表达、功能以及抗病方面的相关研究尚未见报道。
本研究利用马铃薯接种青枯菌，通过构建消减文库[23]，从中选取表达量较高的StZnT11的EST序列。以NCBI数据库为基础，利用电子克隆得到马铃薯中编码StZnT11基因的序列。采用生物信息学方法，对此基因所编码的蛋白质从氨基酸组成、理化性质、分子进化、磷酸化位点等多角度进行了分析并预测蛋白质的结构，进行定量表达分析与组织定位分析。为后续研究该基因的结构和功能奠定基础，并且为马铃薯在青枯病抗性分子机理研究方面提供理论基础。
1 材料与方法1.1 植物与菌株本研究采用的马铃薯(二倍体基因型ED13)植株和青枯菌菌株PO41由中国农业科学院提供。马铃薯ED13基因型对青枯病具有抗性。将无菌块茎ED13种植到装有450 mL泥炭和蛭石(3︰1，体积比)的花盆中(直径10 cm，高度15 cm)。在光照强度、光照时间和温度为2 000–3 000 lx、16 h/8 h (昼/夜)、23 ℃/18 ℃ (昼/夜)的光照培养室中培养。
1.2 生物信息学分析1.2.1 基因克隆从前期工作[23]获得的表达文库中得到EST序列，利用NCBI中的BLAST工具，对EST进行同源性分析，选择与原始序列的相似度、覆盖度、e期望值最高的一条同源对象序列(XM 015308168.1)。通过BioEdit软件拼接序列，得到新基因序列(StZnT11)。
1.2.2 基因序列分析该基因的同源序列、编码蛋白的理化性质、跨膜结构域、亚细胞定位、信号肽分析、磷酸化位点分析利用在线工具[24] Expasy、TMHMM Server V.2.0、PSORT、SignalP 4.1 Server、NetPhos软件完成；蛋白质二级及三级结构的预测利用PSIPRED和SWISS models等在线工具完成[25]。
1.2.3 基因的系统进化树构建利用NCBI中BLAST程序对StZnT11蛋白进行检索，并选择与该蛋白同源性高的不同物种构建系统进化树。将包括番茄、烟草等不同物种植物在内的11条ZnT11蛋白序列放在同一个txt文档，然后再另存为fasta格式。最后利用MEGA 7.0软件建立StZnT11蛋白进化树。
1.2.4 基因的启动子分析用PLACE (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)和PlantCARE (http://bioinformatics. psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html/)搜索StZnT11启动子的1 500 bp序列，定位潜在的顺式作用元件[25]。
1.3 激素处理马铃薯植株长至7–8叶龄期，用100 μmol/L ABA处理，方法参考前人工作[26]。处理后0、12、24、48、60、72 h时间点[27]分别取样，液氮冷存，用于制备RNA。每次处理重复3次。
1.4 青枯菌处理实验取9–10叶龄期的马铃薯幼苗，用108 CFU/mL (OD600=0.2)菌液处理，伤根灌菌法[28]接种。对照组用水处理。处理后0、6、12、24、36、48、60、72、84、96、108 h时间点分别取样，液氮冷存，用于制备RNA。每次处理重复3次。
1.5 用RT-qPCR测定StZnT11基因表达1.5.1 RNA制备苗期马铃薯经激素处理和青枯菌诱导后取样用于总RNA制备，操作如下：取100 μg茎、叶组织，液氮速冻，研磨至粉状，加Trizol试剂4 ℃静置5 min，振荡混匀，室温静置5 min。加1/5体积氯仿，振荡混匀，室温静置5 min。12 000 r/min、4 ℃离心10 min。取上清，加等体积异丙醇，混和均匀，静置10 min。重复离心操作，弃上清取沉淀，用75%乙醇漂洗后置DEPC水保存备用。用LabChip GXll Touch微流控毛细管电泳系统测RNA的RIN值，用NanoDrop2000C超微量分光光度计测RNA的A260/A280和浓度。
1.5.2 cDNA全长的获得取2 μg总RNA按照TransScript II All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒操作，进行反转录成cDNA。反转录反应体系包括Total RNA、5×TransScript II All-in-One SuperMix for qPCR、gDNA Remover、RNase-free水，体积分别为1 μg、4 μL、1 μL、反应体系总体积20 μL。反应条件：50 ℃下进行15 min；在85 ℃下进行5 s。
1.5.3 Real-time PCR以马铃薯Actin基因为内参，引物为Actin-F：5′-TATAACGAGCTTCGTGTTGCAC-3′和Actin-R：5′-ACTGGCATACAGCGAAAGAACA-3′。靶基因StZnT11特异正向引物和反向引物分别为StZnT11-F：5′-GTTGCCATCGGAATCATAATCG-3′和StZnT11-R：5′-ATGAGACTTGTCAATCGAGACC-3′。Real-time PCR反应体系包括正向引物(10 μmol/L) 0.4 μL，反向引物(10 μmol/L) 0.4 μL，2×TransStart Top GreenSuperMix qPCR 10 μL，模板(cDNA) 2 μL，加ddH2O至终体积为20 μL。RT-PCR使用以下程序执行：94 ℃ 2 min；94 ℃ 5 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，45个循环；实验重复3次。
1.6 荧光原位杂交用PO41菌悬液处理9–10叶期的马铃薯幼苗。设置6、12、24、36、48、60、72、84、96 h时间点，分别在每个时间点取样，每株幼苗取少量叶片和2–3个茎段(6–7 cm)。取样后置于10 mL离心管中，将所取植物材料浸泡在植物固定液(85 mL 50%乙醇、10 mL 37%甲醛和5 mL冰醋酸)中固定。将经PCR扩增的StZnT11基因片段制成RNA探针，标记5′-FAM，加入到之前制备的样品石蜡切片中。StZnT11探针序列5′-CATCA GAGAC CTGTGACTGCCCTTGTGCGACT-3′、探针浓度为100 μmol/L，并用FITC (绿光)标记。
2 结果与分析2.1 生物信息学分析本实验室前期[23]获得的EST序列在NCBI中运行Blast搜索到与之相似性较高的1条序列(GenBank登录号XM 015308168.1)，利用BioEdit软件进行电子克隆，得到1 300 bp的序列(图 1)。
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| 图 1 StZnT11基因的cDNA序列及编码的氨基酸 Fig. 1 cDNA sequence of StZnT11 gene and the coded amino acids. The red marker represents the non-coding region, the marked is the CDS coding region, the underlined part is a EST sequence. |
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StZnT11蛋白的一级结构经预测，结果显示：分子式为C1712H2649N433O475S18，原子总数为5 287，分子量为37 474.56 Da，等电点为5.86，负电荷残基(Arg+Glu)为26，正电荷残基(Arg+Lys)为21，不稳定系数为32.61，脂肪系数为106.53，平均总亲水性为0.558。因此推测该蛋白是一个不稳定的疏水性的脂溶性蛋白。利用PSORT软件对StZnT11蛋白进行亚细胞定位分析。结果表明，该蛋白位于质膜上的分值最高，为9.27。故推断，StZnT11蛋白可能存在于植物的质膜上，并在质膜行使功能。通过PSIPRED软件对StZnT11蛋白进行二级结构预测，其中α-螺旋(Alpha helix)占49.28%，β-片层或伸展链(Extended strand)占11.75%，无规则卷曲(Random coil)占38.97%。通过TMHMM Server V.2.0软件对StZnT11蛋白进行跨膜预测，结果显示该蛋白含有9个跨膜区域，预测其为跨膜蛋白。通过NetPhos软件对StZnT11蛋白进行磷酸化位点预测，结果表明该蛋白含23个磷酸化位点。利用SignalP 4.1 Server软件对StZnT11蛋白进行信号肽预测，发现该蛋白含有1个信号肽。故推测，该蛋白为分泌蛋白，在细胞质中合成后，将进行蛋白转运。
2.2 StZnT11蛋白的结构预测和分析利用Robetta软件可以建立一个能够覆盖该蛋白序列全长的三维结构模型，如图 2所示，可见StZnT11蛋白的主要空间结构由α-螺旋和无规则卷曲构成，与其二级结构预测分析一致。
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| 图 2 StZnT11蛋白的三级结构预测 Fig. 2 StZnT11 protein tertiary structure prediction. ① for StZnT11 protein N terminal; ② for StZnT11 protein C terminal. Domain ID: 4105; Confidence: 0.28; Modeling method: comparative modeling; Model span: 1–348. |
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2.3 氨基酸同源性分析及进化树的构建用MEGA7.0软件中的邻接法构建系统进化树，其中包含11个与StZnT11蛋白相关的不同物种的氨基酸序列。进行同源分析后，结果显示(图 3)，从系统发生树上的节点位置和分支长度上分析，StZnT11蛋白与烟草同属一支，与番茄、辣椒的同源性也很高。结果推断它们可能具有共同的起源。
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| 图 3 StZnT11蛋白的系统进化树 Fig. 3 The phylogenetic tree of StZnT11 protein. The evolutionary history was inferred using the Neighbor-Joining method[29]. The optimal tree with the sum of branch length = 2.87 is shown. The percentage of replicate trees in which the associated taxa clustered together in the bootstrap test (500 replicates) are shown next to the branches[30]. The evolutionary distances were computed using the p-distance method[31]. The analysis involved 11 protein sequences. Evolutionary analyses were conducted in MEGA 7.0[32]. |
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2.4 StZnT11启动子预测和分析从马铃薯基因组DNA中获得StZnT11起始密码子ATG上游的1 500 bp碱基。如图 4所示，StZnT11启动子序列分析表明，在StZnT11启动子的1 500 bp区域有33种潜在的顺式作用元件。在许多位置发现了多个核心顺式作用元件，包括TATA box、CAAT box和参与脱落酸应答的顺式作用元件ABRE，以及参与防御和胁迫应答的顺式作用元件TC-rich repeats。启动子区有与激素相关的调控元件，说明StZnT11参与激素调控，并且启动子区有与胁迫相关顺式作用元件，说明StZnT11参与胁迫调控。
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| 图 4 StZnT11启动子预测 Fig. 4 Promoter prediction of StZnT11. The color blocks shown represent different cis elements: green for TATA-box; yellow for CAAT-box; purple for ABRE, as abscisic acid response for cis action element, blue for TC-rich repeats, for defense and stress response for cis action element. |
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2.5 植物激素诱导的StZnT11表达模式StZnT11的表达受外源激素ABA的上调(图 5)，该基因的相对表达在ABA处理72 h后达到峰值。但在96 h时表达量显著降低，而第120 h时表达量又开始上升。表明激素ABA的处理诱导了StZnT11的表达，说明StZnT11的表达可能在激素信号转导过程中发挥重要作用。
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图 5 实时定量PCR分析激素>ABA处理马铃薯苗StZnT11基因相对表达量 Fig. 5 Relative expression of StZnT11 gene in potato seedlings treated with hormone ABA was analyzed by real-time quantitative PCR.  |
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2.6 青枯菌诱导的StZnT11表达模式使用Real-time PCR方法对接种青枯菌的马铃薯幼苗在不同时间点的诱导表达进行比较分析，以确保在青枯菌侵染下StZnT11 mRNA的表达是否发生。比较分析表明：StZnT11基因的表达受青枯菌上调(图 6)，该基因在青枯菌处理6、12、24 h中相对表达量较低；在36 h和48 h中几乎不表达；但在之后的60 h和72 h内表达量又开始上调；直到84 h相对表达量达到最高；而在之后的96 h和108 h中表达量显著下降。由于对照组一直处于较低的表达状态，因此与对照组相比较，当受到病原菌胁迫时，StZnT11基因的表达量会上调。推测StZnT11基因在马铃薯抗青枯病方面发挥重要作用。
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图 6 利用实时定量PCR分析接种青枯菌的马铃薯幼苗StZnT11基因相对表达量 Fig. 6 Relative expression of StZnT11 gene in potato seedlings inoculated with Ralstonia solanacearum species complex was analyzed by real-time quantitative PCR. Water was used as control. Normalization is carried out at each point in time based on the value of actin. The value is the  |
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2.7 StZnT11表达的组织定位荧光原位杂交分析显示(图 7)，StZnT11 mRNA主要分布在茎维管系统的韧皮部(图 7-A3)和叶片维管束(图 7-C3)。此外，在对照植株中观察到弱杂交信号(图 7-B3和7-D3)。这些结果表明，StZnT11基因定位在维管束，表现出一定的组织特异性，这可能与青枯菌所引起的维管束系统病害青枯病有关。
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| 图 7 StZnT11定位在茎维管系统的韧皮部和叶片维管束 Fig. 7 StZnT11 was located in the phloem and leaf vascular bundles of the stem vascular system. The stem and leaf tissues of potato seedlings were taken 48 hours after inoculation with Ralstonia solanacearum species complex, and the localization of StZnT11 protein in cells was observed by laser scanning imaging system. The first column and the second column are blue natural fluorescence, giving priority to the xylem, and the third column is green fluorescence, corresponding to the location of StZnT11. The fourth column is the combined image of the second column of blue fluorescence and the third column of green fluorescence. (A) Stems of potato seedlings inoculated with Ralstonia solanacearum species complex were crosscutting. (B) Stems of potato seedling after water treatment were crosscutting. (C) Leaves of potato seedlings inoculated with Ralstonia solanacearum species complex were crosscutting. (D) Leaves of potato seedling after water treatment were crosscutting. The ruler is 20 μm. |
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3 讨论锌转运蛋白在植物中运输细胞之间以及细胞内的亚细胞之间的金属[8]。调节细胞的多种生命活动。锌转运蛋白的有效利用可以使人们更好地了解植物体内锌稳态和抗性的机制[33]。研究表明拟南芥的AtMTP1定位于液泡膜，参与将细胞质中过量的Zn固定到液泡中以维持Zn的动态平衡[34]。在水稻中，OsZIP5对水稻中锌分布起重要作用[15]。在烟草中，锌转运蛋白Tzn1的表达增强了植物中锌的积累[16]。这些结果与亚细胞定位分析结果一致，锌转运蛋白定位于质膜，并在质膜通过转运Zn2+发挥作用。从前期工作[23]获得的表达文库中得到EST序列，利用电子克隆得到马铃薯中编码StZnT11蛋白的cDNA序列。采用生物信息学方法，对此蛋白质从氨基酸组成、理化性质、分子进化、磷酸化位点、高级结构等多角度进行了分析。结果表明该基因cDNA全长1 300 bp，编码348个氨基酸，编码蛋白含23个磷酸化位点，有1个信号肽，有9个跨膜区域，是定位在质膜上的疏水性蛋白。通过氨基酸序列比对，StZnT11蛋白与烟草、番茄和辣椒的锌转运蛋白同源性高，结果推断它们可能具有共同的起源。
植物激素是植物生长发育的核心调节因子，调节植物对生物和非生物环境胁迫的响应。启动子分析结果表明在许多位置出现多个核心顺式作用元件，包括TATA、CAAT box和参与脱落酸应答的顺式作用元件ABRE，以及参与防御和胁迫应答的顺式作用元件TC-rich repeats。结合植物激素ABA诱导StZnT11的表达结果表明，StZnT11的表达可能在激素信号转导过程中发挥重要作用。马铃薯青枯病属于维管束系统病害，青枯菌从植物根部入侵，到木质部导管发挥作用，通过维管束迅速扩张到地上部分，导致导管丧失功能，进一步引起植物萎蔫，甚至死亡。青枯菌诱导StZnT11的表达与对照组相比较，当植物受到青枯菌胁迫时，StZnT11基因的表达量会上调。结合荧光原位杂交结果显示，StZnT11以组织特异性的方式在维管束表达，而青枯菌作用位置也在维管束。因此推测StZnT11基因在马铃薯抗青枯病方面发挥重要作用。
后续可以使用实验手段克隆StZnT11基因，利用基因过表达、基因沉默和亚细胞定位对StZnT11的功能进行验证。目前在拟南芥[8]、水稻[14]、小麦[17]等植物中对ZnT11进行了相关的研究，还尚未有在马铃薯中研究该蛋白功能的相关报道。笔者借鉴前人的经验对马铃薯中的锌转运蛋白进行研究，推测StZnT11可能为抗病基因，为选育对青枯病具有高抗性的新品种马铃薯奠定基础。
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