周伟¹, 卢进鹏¹, 李亚平¹, 杨林玉¹, 胡小蕾¹, 廖飞², 杨晓兰¹
1. 重庆医科大学 检验医学院 临床检验诊断学教育部重点实验室，重庆 400016;
2. 重庆理工大学 药学与生物工程学院，重庆 400054
收稿日期：2018-07-31；接收日期：2018-11-26；网络出版时间：2018-01-10
基金项目：国家自然科学基金(Nos. 31570862，81773625)资助

摘要：比较Ni²⁺-NTA磁珠和羧基磁珠固定结核分枝杆菌二氢叶酸还原酶(Mycobacterium tuberculosis dihydrofolate reductase，MtDHFR)，探索适合小分子配体混合物库筛选的MtDHFR固定化方法。重组表达带6×His标签MtDHFR，纯化后表征酶学性质，比较用Ni²⁺-NTA磁珠和羧基磁珠固定化时相应固定化容量、保留活性、稳定性及对抑制剂响应。结果表明，Ni²⁺-NTA磁珠对MtDHFR固定化容量为(93±12) mg/g磁珠(n=3)，但酶比活保留不超过32%，Ni²⁺明显抑制酶活性，EDTA与Ni²⁺呈协同抑制效应，Fe³⁺无显著干扰。羧基磁珠活化固定MtDHFR的容量(8.6±0.6) mg/g磁珠(n=3)，固定化酶比活保留(87±4)% (n=3)。在含50 mmol/L KCl的100 mmol/L HEPES (pH 7.0)中，游离和固定化MtDHFR在0 ℃保存16 h活性都无显著改变，但在25℃保存16 h，游离酶活性下降近60%而羧基磁珠固定化MtDHFR活性下降仅35%。甲氨喋呤对游离MtDHFR和固定化MtDHFR的IC₅₀无显著差异(P > 0.05)。综上，Ni²⁺-NTA磁珠不适合固定化MtDHFR；羧基磁珠固定化MtDHFR能保留活性、热稳定性及对抑制剂的响应，该固定化方法有望用于快速筛选其配体混合物库。
关键词：磁珠固定化二氢叶酸还原酶配体混合物筛选
Characterization of Mycobacterium tuberculosis dihydrofolate reductase immobilized on magnetic nanoparticles
Wei Zhou¹, Jinpeng Lu¹, Yaping Li¹, Linyu Yang¹, Xiaolei Hu¹, Fei Liao², Xiaolan Yang¹
1. Key Laboratory of Medical Laboratory Diagnostics of the Ministry of Education of China, College of Laboratory Medicine, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China;
2. School of Pharmacy and Bioengineering, Chongqing University of Technology, Chongqing 400054, China
Received: July 31, 2018; Accepted: November 26, 2018; Published: January 10, 2018
Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 31570862, 81773625)
Corresponding author: Xiaolan Yang. Tel: +86-23-68485240; Fax: +86-23-68485239; E-mail: xiaolanyang666@yeah.net.

Abstract: To explore the immobilization of target proteins for screening libraries of ligand mixtures, magnetic submicron particles (MSP) functionalized with Ni²⁺-NTA and carboxyl were compared for the immobilization of Mycobacterium tuberculosis dihydrofolate reductase (MtDHFR). MtDHFR fused with 6×His was expressed, purified and characterized for kinetics. MtDHFR was immobilized on Ni²⁺-NTA-functionalized MSP directly and carboxyl-functionalized MSP upon activation. The immobilization capacity, residual activity, thermostability and affinities for putative inhibitors were characterized. MtDHFR immobilized on Ni²⁺-NTA-functionalized MSP retained about 32% activity of the free one with the immobilization capacity of (93±12) mg/g of MSP (n=3). Ni²⁺ and EDTA synergistically inhibited MtDHFR activity, while Fe³⁺ had no obvious interference. MtDHFR immobilized on carboxyl-functionalized MSP retained (87±4)% activity of the free one with the immobilization capacity of (8.6±0.6) mg/g MSP (n=3). In 100 mmol/L HEPES (pH 7.0) containing 50 mmol/L KCl, there was no significant loss of the activities of the free and immobilized MtDHFR after storage at 0 ℃ for 16 h, but nearly 60% and 35% loss of their activities after storage at 25 ℃ for 16 h, respectively. The inhibition effects of methotrexate on the immobilized and free MtDHFR were consistent (P > 0.05). The immobilization of MtDHFR on carboxyl-functionalized MSP was thus favorable for higher retained activity and better thermostability, with promise for rapid screening of its ligand mixtures.
Keywords: magnetic particlesimmobilizationdihydrofolate reductaseligand mixturescreening
结核(Tuberculosis，TB)是由致病性结核分枝杆菌引起的全球流行病^[1]。2016年约1 040万人患结核，发病率高于艾滋病，是全球主要的公共卫生问题^[2]。现有结核治疗策略面临复发、药物副作用和多药耐药的风险^[3-5]；应对结核，迫切需要新药^[6-7]。二氢叶酸还原酶(Dihydrofolate reductase，DHFR)是细胞核酸代谢途径关键酶，是肿瘤和细菌感染的治疗靶标^[8-9]。结核分枝杆菌与人的DHFR氨基酸序列一致性仅为26%左右，基于此结构差异有望设计结核分枝杆菌二氢叶酸还原酶(Mycobacterium tuberculosis DHFR，MtDHFR)选择性抑制剂^[10]，使MtDHFR成为结核治疗药物的新靶点^[11-12]。基于靶蛋白发现配体类药物先导化合物主要依靠筛选配体库。因此，建立适合筛选MtDHFR抑制剂库的技术体系，对发现治疗结核的化学新药具有重要意义。
传统方法筛选配体库需制备纯化合物库再高通量筛选，库制备成本高且效率低，筛选过程耗时且成本高。天然产物混合物和组合合成混合物作为配体库价值很大，而且库制备成本低且制备效率高，但筛选此类混合物库的技术难度巨大^[13-15]。药用MtDHFR抑制剂需要具有高亲和力；目前筛选混合库发现高亲和力配体的方法，主要基于亲和结合、靶蛋白配体复合物分离和LC-MS分析^[16-18]，但也仅限于成分含量相差不大的混合物库。天然产物混合物或组合合成混合物中有效成分含量未知或极低，如何发现极低含量的有效成分仍是技术挑战^[19]。本课题组建立了磁分离靶蛋白配体复合物后LC-MS分析筛选混合物组合库的方法^[20-21]；在此基础上，优化竞争结合反应体系实现选择性迭代富集，可快速发现混合物中极低含量的高亲和力配体；LC-MS为成套的分析系统，靶蛋白大量活性表达、在磁珠表面固定化并保留其活性，就成为应用此策略的关键。
此前发现，对带6×His标签融合蛋白可用Ni²⁺-NTA磁珠位点选择性固定化以期保留活性^[22]，但固定化体系必需Ni²⁺等重金属离子，而这些重金属离子可能影响固定化酶的活性。羧基磁珠也是固定化蛋白的常用载体，此固定化体系基本不会有重金属离子残留干扰酶活性。本研究经重组表达获得MtDHFR，比较Ni²⁺-NTA磁珠和活化羧基磁珠固定化对MtDHFR活性、稳定性及抑制剂响应的影响，以探索适合磁分离筛选配体混合物库的MtDHFR固定化方案。
1 材料与方法1.1 试剂与器材Ni²⁺-NTA磁珠(批号20170714，100 g/L)、羧基磁珠(Magnetic submicron particles carboxyl subtype F1，MSP-COOH-F1，批号20171121，120 g/L)购自重庆博蓝鹰生物技术有限公司；三乙醇胺(Trolamine，TEA)、甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(β-NADPH)、β-巯基乙醇购自Aladdin；六水合氯化镍、硫酸铁、异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)、硫酸卡那霉素、2-吗啉乙磺酸(4-Morpholineethanesulfonic acid，MES)购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；4-羟乙基哌嗪乙磺酸(4-(2-hydroxyerhyl) piperazine-1-erhaesulfonic acid，HEPES)购自北京索莱宝科技有限公司；E. coli BL21 (DE3)购自成都擎科梓熙生物技术有限公司；pET28a购自中美泰和生物技术有限公司；Ni²⁺-NTA层析柱购自南京金斯瑞生物科技有限公司；二氢叶酸(Dihydrofolic acid，DHF)购自Sigma公司；N-羟基琥珀酸亚胺(N-Hydroxysuccinimide，NHS)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(1-(3-Dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide，EDC)购自东京化成工业株式会社，其他试剂均为国产分析纯。日本岛津UV-2550紫外可见分光光度计(带恒温系统)；其林贝尔QB-9001快速振荡器；Promega 12孔磁分离架；Millipore 8050型超滤杯及再生纤维素超滤膜(截留蛋白分子量 > 10 kDa)。
1.2 MtDHFR重组表达纯化及表征1.2.1 MtDHFR重组表达纯化含N端携带6×His标签的pET28a(+):dfrA表达质粒^[23]委托中美泰和生物技术有限公司合成。质粒转化至感受态E. coli BL21 (DE3)培养，经单克隆测序鉴定后，于含有100 mg/L卡那霉素LB液体培养基中，参照文献[23]进行6×His-MtDHFR表达和纯化。用含50 mmol/L KCl的20 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 7.0)氮气正压(0.15-0.20 Mpa)超滤浓缩收集蛋白，Bradford法测蛋白浓度^[24]，15% SDS-PAGE分析蛋白纯度；所得酶蛋白溶液于?80 ℃保存。
1.2.2 MtDHFR的酶学性质表征MtDHFR活性测定：DHF用含10 mmol/L β-巯基乙醇的50 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 7.0)溶解至1.0 mmol/L溶液，β-NADPH用去离子水溶解至1.0 mmol/L溶液；反应缓冲液为含50 mmol/L KCl的100 mmol/L HEPES (pH 7.0) ^[25]。MtDHFR用反应缓冲液稀释至40 mg/L。紫外分光光度计恒温至25 ℃，反应缓冲液调零，反应总体积为1.0 mL，加终浓度均为50 μmol/L的β-NADPH和DHF，400 ng MtDHFR，混匀后延迟10 s用光度计连续监测340 nm处3 min内的消光变化；取消光变化线性范围内的速度(ΔA/min)作为初始反应速度(V)，按设定的底物消耗消光系数(ε= 11 800 L/(mol·cm)^[26]计算酶活力，1.0 min内转化1.0 μmol底物所需酶量为一个活力单位。
MtDHFR米氏常数：文献报道β-NADPH对MtDHFR的米氏常数K_mNADPH和DHF的米氏常数K_mDHF均约4 μmol/L^[27]。对于双底物酶，使其中一个底物浓度大于10 K_m时改变另一底物浓度测定酶活，双倒数分析确定表观K_m^[28]。在1.0 mL含400 ng酶测定体系中，固定DHF终浓度为50 μmol/L，在2-10 μmol/L间改变β-NADPH终浓度(S)，测定初始反应速度(V)，回归分析1/V对β-NADPH浓度倒数1/S响应得K_mNADPH；固定β-NADPH终浓度50 μmol/L，在(0.5-10) μmol/L间改变DHF浓度，同法测定K_mDHF。
MtDHFR热稳定性：室温筛选配体操作过程不超过4 h^[20-21]。用酶反应缓冲液将MtDHFR稀释到0.1 g/L，于25 ℃和0 ℃保存，不同时刻取MtDHFR溶液10 μL，25 ℃测定酶活分析其变化。
1.3 Ni²⁺-NTA磁珠固定MtDHFR及表征1.3.1 Ni²⁺-NTA磁珠固定MtDHFR取Ni²⁺-NTA磁珠悬液(100 g/L)，磁力回收磁珠后用固定缓冲液(pH 7.0，20 mmol/L Tris-HCl)洗3次并重悬为7.5 g/L。取不同浓度MtDHFR溶液40 μL预冷到0 ℃，200 r/min缓慢加入10 μL Ni²⁺-NTA磁珠(约75 μg)，冰水浴中200 r/min振摇30 min；磁力分离取上清备测剩余蛋白，磁珠用固定缓冲液小心洗涤3次，每次200 μL，再重悬为3 g/L，于0 ℃保存待用。
1.3.2 Ni²⁺-NTA磁珠固定MtDHFR的容量及固定酶活性用Bradford法测酶蛋白量^[24]。固定时所用酶蛋白总量与上清酶蛋白量之差为固定化酶量。取饱和固载时单位量Ni²⁺-NTA磁珠固定酶量为固定化容量。用终点法测定固定化MtDHFR活性；在25 ℃恒温的1.0 mL酶反应体系中，加30 μg固定化MtDHFR的磁珠，反应3 min后分离全部磁珠测定上清消光，以不加固定酶磁珠为对照计算消光之差及其变化速度(ΔA/min)。
1.3.3 Ni²⁺、Fe³⁺及EDTA对MtDHFR活性的影响将NiCl₂、Fe₂(SO₄)₃、EDTA用酶反应缓冲液配成5 mmol/L溶液。在1.0 mL酶反应缓冲液中，加不同终浓度的Ni²⁺、EDTA、Fe³⁺，分别与400 ng MtDHFR在冰上200 r/min作用不同时间；Ni²⁺ 与EDTA作用20 min后再加MtDHFR 400 ng冰上作用不同时间；然后恒温25 ℃加底物测定酶活性。
1.4 羧基磁珠固定MtDHFR及表征1.4.1 活化羧基固定MtDHFR取MSP-COOH-F1悬液(120 g/L)，用10 mmol/L MES缓冲液(pH 6.0)的洗3次并重悬至3 g/L。NHS和EDC分别用预冷10 mmol/L MES (pH 6.0)配成75 mmol/L、50 mmol/L溶液。取200μL磁珠悬液(约600 μg)，磁力分离去上清后加NHS和EDC各100 μL (摩尔比1.5:1.0)^[29]，或各50 μL再补充缓冲液至总体积200 μL，室温200 r/min振摇反应30 min后磁力回收磁珠，用预冷到0 ℃的固定缓冲液(pH 7.0的10 mmol/L MES)洗3次并重悬至15 g/L，于0 ℃保存(尽快使用)。在预冷到0 ℃含一定量MtDHFR的210 μL固定缓冲液中，分批加入预冷的活化羧基磁珠40μL (600 μg)；在0 ℃固定反应30 min，每隔3 min混匀一次。磁力回收磁珠，用酶反应缓冲液洗涤并重悬至3 g/L，于0 ℃保存备用。参照Ni²⁺-NTA磁珠固定化酶方法测定固定酶量。
1.4.2 光度法连续跟踪磁珠固定酶反应过程测定MtDHFR活性于1.0 mL酶反应体系中，分别在含底物50 μmol/L DHF、50 μmol/L β-NADPH的反应缓冲液中加240 μg MSP-COOH-F1及1.0 μg酶，25 ℃下比较底物加磁珠前后340 nm消光值A₃₄₀及其在酶作用下变化速度(ΔA/min)，以消除磁珠对测定消光变化速度的影响。测定磁珠固定化酶活性时，在25 ℃的1.0 mL酶反应体系中加75 μg固定酶磁珠，以10 s间隔连续监测3 min内340 nm处消光变化，并计算消光变化速度(ΔA/min)及对应酶活性。
1.4.3 羧基磁珠固定化MtDHFR和游离MtDHFR对MTX的响应于1.0 mL酶反应体系中，加75 μg固定酶磁珠或0.5 μg游离酶，及不同终浓度MTX (1.0-10.0 nmol/L)，25 ℃混匀3 min后加底物测定酶活。用OriginPro 9.1拟合抑制率对MTX浓度对数响应确定甲氨蝶呤对MtDHFR的IC₅₀。
1.4.4 羧基磁珠固定MtDHFR储存稳定性将固定酶磁珠(3.0 g/L)于25 ℃水浴和冰水浴0 ℃中静置保存，于不同时刻取75 μg磁珠测定酶活性；分析活性随保存时间的变化。
1.5 数据处理方法每个实验重复3次，实验结果表示为平均值±标准偏差(x±s)；采用OriginPro 9.1进行数据处理；统计学处理采用SPSS 20.0，t检验分析，P < 0.05为具有显著性差异。
2 结果与分析2.1 MtDHFR表达和纯化6×His-MtDHFR诱导表达后，粗酶液经Ni²⁺-NTA亲和层析单次纯化，蛋白收率约为12%，比活提高到15倍；超滤浓缩3次，蛋白收率约为30%，但比活提高近30%。纯化总倍数约21倍(表 1)。可见，高纯度MtDHFR易于获得。SDS-PAGE显示较纯的目的蛋白条带(图 1)，分子量约为20 kDa，符合预期。
表 1 MtDHFR表达纯化效果(x±s, n=3)Table 1 Expression and purification of MtDHFR (x±s, n=3)

Purification steps	Total protein (mg)	Total activity (U)	Specific activity (U/mg)	Purified fold	Recovery rate (%)
Crude extract	135±12	30±1.5	0.2±0.1
Purification from Ni2+-NTA	16±1.2	50±4.0	3.1±0.2	15.5	12
Ultra-filtration	4.8±0.4	20±1.7	4.2±0.2	21.0	30

表选项

图 1 SDS-PAGE检测6×His-MtDHFR的纯化 Fig. 1 SDS-PAGE analysis of 6×His-MtDHFR after purification by Ni2+-NTA. Lane 1: lysate; lane 2: supernatant; lane 3: sediment; lane 4: flow through fractions; lane 5: fractions eluted with 10 mmol/L imidazole; lane 6: fractions eluted with 20 mmol/L imidazole; lane 7: fractions of target eluted with 500 mmol/L imidazole; M: marker.

图选项

2.2 MtDHFR米氏常数及其受pH的影响2.2.1 MtDHFR米氏常数双倒数分析得K_{m DHF}为(4.4±0.2) μmol/L (n=3) (图 2A)，K_{m NADPH}为(4.7±0.5)μmol/L (n=3) (图 2B)，都与文献报道^[27]接近。

图 2 DHF (A)和β-NADPH (B)的表观Km Fig. 2 Km of DHF (A) and β-NADPH (B).

图选项

2.2.2 pH对MtDHFR活性影响在pH 4.0-8.0的50 mmol/L磷酸盐缓冲液中，MtDHFR活性随pH增大而降低，到pH 8.0时几乎无活性(图 3)。MtDHFR活性在pH 7.0的100 mmol/L HEPES和pH 7.0的50 mmol/L磷酸盐中无差异，故用pH 7.0的HEPES测定酶活性^[25]。

图 3 MtDHFR活性的pH效应 Fig. 3 pH effect on MtDHFR activity.

图选项

2.3 Ni²⁺-NTA磁珠固定MtDHFR及其表征2.3.1 Ni²⁺-NTA磁珠固定MtDHFR容量及保留活性用75 μg Ni²⁺-NTA磁珠，随MtDHFR用量增加，固定化酶量逐渐增加直至饱和(图 4)，固定化容量为(93±12) mg/g磁珠(n=3)。固定化酶比活随MtDHFR用量增加而缓慢增加至稳定，但最大比活保留仅约为游离酶的32%。

图 4 MtDHFR活性的pH效应75 μg Ni2+-NTA磁珠基于6×His固定MtDHFR的固定化量和表观比活保留比 Fig. 4 Immobilization capacity and residual activity percentage of 6×His-MtDHFR on Ni2+-NTA MSPs of 75 μg.

图选项

2.3.2 Ni²⁺、Fe³⁺及EDTA对酶活的影响Ni²⁺在5-20 nmol/L之间对MtDHFR活性产生浓度和时间依赖性抑制，20 nmol/L Ni²⁺抑制大于50% (图 5A)。Fe³⁺对MtDHFR活性没有明显影响(图 5B)。单独EDTA对MtDHFR活性可抑制大于30%且依赖其浓度；Ni²⁺与MtDHFR作用前后加EDTA对MtDHFR活性抑制大于60%，有协同抑制效应(图 5C)。Ni²⁺-NTA磁珠中含游离Ni²⁺，其可能降低固定酶活力且EDTA不能逆转。

图 5 Ni2+(A)、Fe3+(B)、EDTA (C)对酶活性的影响 Fig. 5 Effects of Ni2+, Fe3+and EDTA on MtDHFR activity. (A) Ni2+. (B) Fe3+. (C) EDTA alone and it plus Ni2+ in 100 mmol/L HEPES buffer at pH 7.0.

图选项

2.4 羧基磁珠固定MtDHFR及其表征2.4.1 羧基磁珠对酶活测定的干扰常规方法测定磁珠固定化酶活，需在固定化酶初速度反应阶段终止反应并分离磁珠，再测定反应液的吸收变化计算固定化酶活。由于反应终点的确定易产生误差并干扰反应液吸收的测定，使固定化酶活测定重现性较低，故需考察不分离磁珠连续监测反应测定酶活的可行性。所用磁珠悬浮稳定性好，其在有限时段内对340 nm消光变化速度影响应该很小。在1.0 mL酶反应体系中，150 mg/L羧基磁珠、50 μmol/L β-NADPH和50 μmol/L DHF及其混合物，在340 nm的消光A₃₄₀构成恒定本底；在游离酶存在时，外加终浓度75、150、240 mg/L羧基磁珠，对光度法跟踪酶反应过程测定游离酶活性无影响。因此，磁珠对固定酶活测定无显著干扰。本实验限制固定酶磁珠用量，用光度法连续跟踪测定固定化酶活性。
2.4.2 羧基磁珠固定MtDHFR容量及保留活性活化羧基磁珠约600 μg，MtDHFR用量在5-200 μg之间，固定化容量基本不变(图 6)；最大固定化蛋白量约5.2 μg，对应固定化容量为(8.6±0.6) mg/g磁珠(n=3)。不分离磁珠，连续跟踪固定化酶反应过程并测定固定化酶活性，所得固定化酶表观比活保留比例变化如图 6所示。在约600 μg活化羧基磁珠中，加入MtDHFR量从5-200 μg进行固定时，磁珠固定化酶的表观比活保留比例先增加后逐渐降低至稳定，在酶用量10 μg时其表观比活保留87%，而酶用量20-200 μg时磁珠固定化酶表观比活保留比例稳定在75%。为保留固定酶活性，选择酶量:磁珠量比为1:60。

图 6 羧基磁珠固定酶活保留比例及固定化量对加入酶量的响应 Fig. 6 Immobilized quantity and retention percentages of apparent specific activities in response to amounts of enzyme added for immobilization on MSP-COOH-F1.

图选项

2.4.3 游离和羧基磁珠固定MtDHFR的储存稳定性游离和羧基磁珠固定化MtDHFR在反应缓冲液0 ℃保存16 h活性均无显著改变(图 7)；游离MtDHFR在25 ℃下反应缓冲液中保存2 h后活性持续降低，4 h下降超过10%，16 h降低近60%；固定化酶25 ℃保存4 h活力仅下降4%，16 h下降仅35%。在混合物库筛选中，从配体竞争结合固定化酶到磁分离洗涤的全流程，操作时间不超过4 h，故此固定化MtDHFR稳定性满足混合物筛选要求。

图 7 游离酶和羧基磁珠固定MtDHFR的稳定性 Fig. 7 Stability of the free and MSP-COOH-F1 immobilized MtDHFR.

图选项

2.4.4 MtDHFR羧基磁珠固定前后对MTX的IC₅₀MtDHFR在羧基磁珠上固定前后对MTX的IC₅₀无显著差异(P > 0.05) (图 8)，且都与文献报道结果接近^{[25, 27]}。可见，用MSP-COOH-F1固定化MtDHFR适合筛选其高亲和力抑制剂。

图 8 MTX对游离酶和羧基磁珠固定MtDHFR的IC50 Fig. 8 IC50 of MTX against free and MSP-COOH-F1 immobilized MtDHFR.

图选项

3 讨论本研究构建N端带6×His标签的MtDHFR表达载体pET28a，在E. coli BL21 (DE3)中成功重组表达并纯化。比较发现，不同磁珠固定化重组MtDHFR有显著差异。6×His-MtDHFR通过其6×His标签与Ni²⁺-NTA磁珠螯合，属于位点选择性固定化，但不适合用于磁分离筛选MtDHFR的高亲和力配体。首先，Ni²⁺-NTA磁珠固定化酶保留活性很低。其次，Ni²⁺-NTA鳌合带6×His标签酶复合物稳定性对pH敏感，在pH 8.0及以上鳌合酶才能维持固定化状态。但是，6×His-MtDHFR在pH 8.0时保留的活性很低而不适合筛选其抑制剂。相反，MtDHFR氨基酸序列仅有1个赖氨酸(Lys-53)及N端伯氨基，三维结构(PDB code: 4KNE)中，此赖氨酸及其N端伯氨基都远离活性位点^[23]，可通过伯氨基与磁珠表面羧基生成酰胺固定化；这种固定化实际上也属于位点选择性固定化。MSP-COOH-F1表面为兼性离子对修饰层并带长连接臂的羧基适合固定蛋白，而磁珠对疏水小分子的非特异吸附弱。优化条件后，此羧基磁珠固定MtDHFR达到(8.6±0.6) mg/g磁珠，特别是固定化酶保留(87±4)%活性，固定前后其对MTX的IC₅₀无显著差异，而固定化酶在4 h内稳定。所以，用此羧基磁珠固定化MtDHFR有望用于配体混合物库中高亲和力配体的选择性富集与筛选。
用MSP-COOH-F1羧基磁珠固定化MtDHFR时，磁珠表面羧基活化程度不宜太高，对设定量磁珠存在最优酶蛋白用量。可能磁珠固定蛋白量少而使位阻小，有利于固定化酶结合底物。对MSP-COOH-F1，酶蛋白量对磁珠量比例接近1:60，有利于获得高保留活性固定化酶。MSP-COOH-F1羧基固定化MtDHFR后悬浮稳定性好，光度法连续监测反应混合物消光(考虑磁珠对光的散射故称为消光)适合测定酶活性。
总体而言，6×His-MtDHFR适合在大肠杆菌大量表达，通过成酰胺键固定在MSP-COOH-F1上适用于磁分离筛选其抑制剂混合物库。后续工作正在进行中。
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