1. 辽宁大学 生命科学院 植物表观遗传与进化实验室，辽宁 沈阳 110036;
2. 辽宁省水土保持研究所，辽宁 朝阳 122000
收稿日期：2018-05-25；接收日期：2018-08-13
基金项目：国家自然科学基金(No. 31100172)，辽宁省高等学校优秀人才支持计划(No. LJQ2013003)，辽宁省科技厅自然基金指导计划(No.20180550686)，沈阳市科技局项目(No. F16-205-1-49)资助
摘要：DNA甲基化是真核生物一种重要的表观修饰形式。为了探讨谷子基因组DNA胞嘧啶甲基化的水平和模式，以谷子Setaria italica的两个品种朝谷58号和豫谷1号为实验材料，利用EcoRⅠ和HpaⅡ /MspⅠ双酶切建立适合于谷子基因组的甲基化敏感扩增多态性(MSAP)分析体系。结果表明，从100对MSAP选扩引物中，筛选出32对MSAP引物组合，在朝谷58号和豫谷1号中分别扩增产生1 615、1 482条清晰可辨且可重复的DNA条带，其中包括3种类型的甲基化条带，朝谷58号和豫谷1号的基因组中CCGG序列胞嘧啶甲基化水平分别为6.93%和8.77%。这种谷子不同品种间甲基化水平和分布位点的差异为从表观遗传学的角度培育新品种提供了初步的理论依据和参考。
关键词：DNA甲基化谷子甲基化敏感扩增多态性(MSAP)
Analysis of genomic DNA methylation level in foxtail millet by Methylation Sensitive Amplified Polymorphism
Yuxin Zhang1, Yanan Ruan1, Chen Zhao1, Minmin Xue1, Bo Li1, Jingjing Wang1, Yang Liu1, Kaixi Wang2, Hongyan Wang1
1. Laboratory of Plant Epigenetics and Evolution, School of Life Sciences, Liaoning University, Shenyang 110036, Liaoning, China;
2. Liaoning Institute of Soil and Water Conservation, Chaoyang 122000, Liaoning, China
Received: May 25, 2018; Accepted: August 13, 2018
Supported by: Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31100172), Program for Liaoning Excellent Talents in University (No.LJQ2013003), Guidance Program of Natural Science Fundation, Department of Science and Technology, Liaoning Province (No.20180550686), and Project in Shenyang Science and Technology Bureau (No. F16-205-1-49)
Corresponding author: Hongyan Wang.Tel:+86-24-62202232;E-mail:hongyan2003@126.com.
Abstract: DNA methylation is an important type of epigenetic modification in eukaryotes. In order to research genome-wide methylation levels and patterns in foxtail millet (Setaria italica), the Methylation Sensitive Amplified Polymorphism (MSAP)analysis (employing double digestion with EcoR I and Hpa II/Msp I) was established and applied in two foxtail millet cultivars(Chaogu 58 and Yugu 1). The results showed that 32 pairs of MSAP primers were selected from 100 MSAP primers, and 1 615and 1 482 clearly distinguishable and reproducible bands were amplified from Chaogu 58 and Yugu 1 respectively, including3 types of methylation patterns. Cytosine methylation levels of CCGG context in Chaogu 58 and Yugu 1 were characterized as6.93% and 8.77% respectively. Such different genomic DNA methylation levels between two foxtail millet varieties mayprovide a preliminary reference for the cultivation of this crop from a novel epigenetic viewpoint.
Keywords: DNA methylationfoxtail millet (Setaria italica)methylation-sensitive amplification polymorphism (MSAP)
DNA甲基化是一种重要的表观遗传学修饰方式，与许多重要的生物过程相关，其中包括染色质结构维持、基因印记、细胞分化等[1]。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase)的催化作用下，将S-腺苷甲硫氨酸(SAM)上的甲基转移到胞嘧啶的第5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)[2]。植物细胞中，DNA甲基化主要发生在CG、CHG和CHH位点上(H指A、C、T三种碱基)，由不同的DNA甲基转移酶调控[3]。DNA甲基化主要分布于着丝粒区和重复序列中，其中转座子常常被高度甲基化，使得植物的基因组保持相对稳定[4]。植物的甲基化水平会因为物种、器官、生长时期不同而不同，并以此来调节植物生长发育、器官分化甚至影响植物进化[1, 4-7]。随着对DNA甲基化研究的不断深入，已经发展了很多方法来检测DNA甲基化的水平，其中MSAP技术以其多态性高、信息量大、操作简单等优点被广泛应用于植物DNA甲基化检测[7-10]。
甲基化敏感扩增多态性，即MSAP技术(Methylationsensitive amplified polymorphism)是由AFLP (Amplified fragment lengthpolymorphism)技术发展而来的[5]。其原理是运用限制性内切酶HpaⅡ和MspⅠ识别CCGG序列，限制性内切酶EcoRⅠ识别GAATTC序列，将HpaⅡ和MspⅠ分别和EcoRⅠ组合对基因组进行酶切，再加上相应的限制性内切酶的接头，根据接头序列设计引物，对CCGG位点甲基化进行特异性扩增[6-7]。虽然HpaⅡ和MspⅠ两种限制性内切酶识别的位点相同，但两者对DNA甲基化敏感程度存在很大的差异，利用其敏感性的不同可以检测出总甲基化水平，并区分DNA的全甲基化和半甲基化等甲基化状态。已有众多研究者采用这一方法取得了一系列的研究成果，王聪聪等利用MSAP技术分析不同单株叶籽银杏DNA甲基化水平与模式，统计发现不同单株DNA甲基化水平差异极显著，正常银杏DNA甲基化水平低于叶籽银杏DNA甲基化水平[8]。Zheng等利用MSAP技术评估水稻两个品种在幼苗期处于正常条件和干旱胁迫下的原代和第6代的DNA甲基化变化，发现29%干旱诱导的DNA甲基化变异位点在胁迫解除后仍然可以保持，并且在干旱条件下DNA甲基化的变异具有组织特异性，其中分蘖期比抽穗期和孕穗期的甲基化水平显著下降[9]。李照令等利用MSAP技术研究不同浓度Cd处理对拟南芥幼苗基因组DNA甲基化水平的影响，发现3个处理组的DNA甲基化水平均高于对照，并且随着处理浓度的增加，其甲基化水平随之降低[10]。
谷子又称为粟，是起源于我国的传统优势作物之一，一直在北方大面积种植。由于谷子具有抗旱耐瘠、水分利用率高、适应性强、营养价值高等优点，近年来受到研究人员的重视[11]。谷子的测序工作在2012年完成，基因组大小约为515 Mb，基因组序列相对较小，富含重复序列，并且有一些转录组测序也已完成，为功能基因的研究提供了良好条件[12-15]。但在表观遗传学的研究领域，关于谷子的研究还处于刚刚起步的阶段，谷子在正常生长条件下全基因组甲基化的水平尚未深入研究。因此，本研究以两个优势种——朝谷58号和豫谷1号为例，对谷子基因组DNA胞嘧啶甲基化水平进行评估，以了解谷子在正常生长条件下全基因组甲基化水平差异和模式特点，以期为进一步从表观遗传学的角度培育谷子新品种提供初步的理论依据和参考。
1 材料与方法1.1 材料朝谷58号和豫谷1号，分别由辽宁省水土保持研究所和中国农业科学院作物科学研究所提供。其中，豫谷1号是目前谷子遗传研究中应用最广泛的品种，也是基因组测序的品种[15-16]；朝谷58是适应辽西干旱半干旱地区自然条件的优秀品种，抗逆性强，且丰产稳产，是谷子抗逆性状基因挖掘的好材料[17]。两个品种均播种于灭菌土壤中，并在自然光照条件下生长，8周后选取叶片完全展开且长势一致的倒三叶、倒四叶叶片进行采集，液氮冷冻后在?80 ℃冰箱中保存。
1.2 方法1.2.1 DNA提取采用改良的CTAB方法提取谷子叶片的基因组DNA[18]。所用试剂购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
1.2.2 DNA甲基化敏感多态性分析分别用EcoRⅠ/HpaⅡ、EcoRⅠ/MspⅠ组合对基因组DNA进行酶切，连接接头(表 1)，实验所用酶购买自NEB公司，所用引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表 2)。每对引物进行5%的聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染后对清晰可辨、可重复的带型进行记录，并对其位点进行MSAP分析。实验根据泳道内有无条带，将清晰可重复的条带记为“1”，同一位置没有条带记为“0”。统计每对引物扩增出的总条带数和其中的甲基化条带数，每个引物组合做3次重复。
表 1 MSAP接头Table 1 MSAPadapters
| Adapters | Sequences (5’–3’) |
| EcoRⅠ-adapterⅠ | CTCGTAGACTGCGTACC |
| EcoRⅠ-adapterⅡ | AATTGGTACGCAGTC |
| HpaⅡ/MspⅠ- adapterⅠ | GATCATGAGTCCTGCT |
| HpaⅡ/MspⅠ- adapterⅡ | CGAGCAGGACTCATGA |
表选项
表 2 MSAP扩增引物Table 2 MSAPamplification primers
| EcoRⅠprimers | Sequences (5’–3’) | HpaⅡ/MspⅠprimers | Sequences (5’–3’) |
| E+A | GACTGCGTACCAATTCA | H/M +0 | ATCATGAGTCCTGCTCGG |
| E-AAC | GACTGCGTACCAATTCAAC | H/M-TCT | ATCATGAGTCCTGCTCGGTCT |
| E-AAG | GACTGCGTACCAATTCAAG | H/M-TCG | ATCATGAGTCCTGCTCGGTCG |
| E-ACA | GACTGCGTACCAATTCACA | H/M-TCC | ATCATGAGTCCTGCTCGGTCC |
| E-ACT | GACTGCGTACCAATTCACT | H/M-TTC | ATCATGAGTCCTGCTCGGTTC |
| E-ACC | GACTGCGTACCAATTCACC | H/M-TTG | ATCATGAGTCCTGCTCGGTTG |
| E-ACG | GACTGCGTACCAATTCACG | H/M-TTA | ATCATGAGTCCTGCTCGGTTA |
| E-AGC | GACTGCGTACCAATTCAGC | H/M-TGA | ATCATGAGTCCTGCTCGGTGA |
| E-AGG | GACTGCGTACCAATTCAGG | H/M-TGT | ATCATGAGTCCTGCTCGGTGT |
| E-AGA | GACTGCGTACCAATTCAGA | H/M-TGC | ATCATGAGTCCTGCTCGGTGC |
| E-ATC | GACTGCGTACCAATTCATC | H/M-TAC | ATCATGAGTCCTGCTCGGTAC |
| Note: E and H/M represent EcoRⅠand HpaⅡ/MspⅠ, respectively. | |||
表选项
酶切连接体系、预扩、选扩体系参照Wang等反应体系进行[19]。
PCR产物电泳及银染：PCR扩增后的产物经5%聚丙烯酰胺凝胶电泳及硝酸银染色后，统计凝胶上各种模式的片段[19]。
2 结果与分析2.1 引物筛选和DNA甲基化图谱构建本研究是通过使用EcoRⅠ和HpaⅡ/MspⅠ的引物组合扩增PCR片段，从而得到基因组甲基化“CCGG”位点的变异模式，引物组合由10个EcoRⅠ引物和10个HpaⅡ / MspⅠ引物自由组合而成，共100对组合。从中筛选出32对可以扩增出条带分布均匀、带多清晰的引物组合完成选择性扩增实验，以朝谷58号为例，选用的32对引物组合及其扩增条带的统计情况见表 3。
表 3 朝谷58号32对引物组合及其扩增条带统计表Table 3 Statistical table of 32 pairsof primers and theiramplified bands in Chaogu 58
| No. | EcoR I+3 primers | H/M+3 primers | Amplified bands |
| 1 | E-AAC | H/M-TCT | 46 |
| 2 | E-AAC | H/M-TTC | 51 |
| 3 | E-AAC | H/M-TTA | 40 |
| 4 | E-AAC | H/M-TCC | 49 |
| 5 | E-AAG | H/M-TTC | 55 |
| 6 | E-AAG | H/M-TTA | 48 |
| 7 | E-ACA | H/M-TTG | 66 |
| 8 | E-ACA | H/M-TTA | 53 |
| 9 | E-ACT | H/M-TCG | 44 |
| 10 | E-ACT | H/M-TTA | 58 |
| 11 | E-ACT | H/M-TGT | 30 |
| 12 | E-ACT | H/M-TGC | 38 |
| 13 | E-ACC | H/M-TCG | 43 |
| 14 | E-ACC | H/M-TTG | 45 |
| 15 | E-ACC | H/M-TTA | 55 |
| 16 | E-ACC | H/M-TGC | 40 |
| 17 | E-ACG | H/M-TTA | 39 |
| 18 | E-ACG | H/M-TCC | 28 |
| 19 | E-AGC | H/M-TTC | 42 |
| 20 | E-AGC | H/M-TTA | 61 |
| 21 | E-AGG | H/M-TCC | 54 |
| 22 | E-AGG | H/M-TTA | 50 |
| 23 | E-AGG | H/M-TGC | 43 |
| 24 | E-AGA | H/M-TCT | 51 |
| 25 | E-AGA | H/M-TCG | 52 |
| 26 | E-AGA | H/M-TTC | 57 |
| 27 | E-AGA | H/M-TTA | 72 |
| 28 | E-ATC | H/M-TTC | 66 |
| 29 | E-ATC | H/M-TTG | 73 |
| 30 | E-ATC | H/M-TTA | 48 |
| 31 | E-ATC | H/M-TGT | 69 |
| 32 | E-AGC | H/M-TCG | 50 |
| Note: E and H/M represent EcoRⅠand HpaⅡ/MspⅠ, respectively. | |||
表选项
MSAP中HpaⅡ和MspⅠ是两种同裂酶，它们的酶切位点均为CCGG，但二者对酶切位点甲基化修饰的敏感性不同，其中HpaⅡ可以识别并切开外侧胞嘧啶半甲基化位点，MspⅠ可以识别并切开内侧胞嘧啶全甲基化位点[20]。因此DNA样品经EcoRⅠ/HpaⅡ (H)和EcoRⅠ/MspⅠ (M)酶切扩增后的产物在PAGE胶上会出现如下3种甲基化类型：Ⅰ型：E+H和E+M都有带，表明CCGG位点未发生甲基化；Ⅱ型：E+H有带，E+M无带，表明CCGG位点处于半甲基化状态，即DNA甲基化只发生在一条链上，其互补链上没有；Ⅲ型：E+H无带，E+M有带，表明CCGG序列中的内侧CG位点处于全甲基化状态，即DNA甲基化同时发生在两条链的内侧胞嘧啶上。图 1展示了朝谷58号和豫谷1号不同引物的选择性扩增图谱，表 4统计了朝谷58号和豫谷1号的胞嘧啶甲基化水平。
 |
| 图 1 朝谷58号(A)和豫谷1号(B)不同引物组合选择性扩增图 Fig. 1 Selective amplification plot of Chaogu 58 (A) and Yugu 1 (B) by different primer combinations.Primer combinations: a: E-AAC H/M-TTA; b: E-ATC H/M-TTG; c: E-AGA H/M-TCT; d: E-AACH/M-TCC; e: E-ACT H/M-TTA; f: E-AGG H/M-TCC;?: methylation variation site. |
| 图选项 |
表 4 朝谷58号和豫谷1号的胞嘧啶甲基化水平Table 4 Cytosine methylation levels of Chaogu 58 and Yugu 1
| Sample | Band type | Total amplified bands | Non methylated rate (%) | Total methylated rate (%) | Fully methylated ratio (%) | Hemi methylated ratio (%) | ||
| Ⅰ | Ⅱ | Ⅲ | ||||||
| Chaogu 58 | 1 503 | 43 | 69 | 1 615 | 93.07 | 6.93 | 4.27 | 2.66 |
| Yugu 1 | 1 352 | 35 | 95 | 1 482 | 91.23 | 8.77 | 6.41 | 2.36 |
| Note: total methylated rate (%) = [(Ⅱ+Ⅲ)/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ)]×100;fully methylated ratio(%) =[(Ⅲ)/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ)]×100;hemi methylated ratio(%) = [(Ⅱ)/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ)]×100; non methylated ratio(%) = [(Ⅰ)/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ)]×100. | ||||||||
表选项
2.2 甲基化修饰水平分析2.2.1 朝谷58号的甲基化水平从100对MSAP选扩引物中，选出32对适合朝谷58号的MSAP引物组合，共扩增产生1 615条清晰可辨且可重复的DNA条带。从表 4可以看出，辽宁省优势品种朝谷58在全基因组水平上CCGG位点胞嘧啶甲基化比例为6.93%，其中内侧全甲基化比例为4.27%，单链半甲基化比例为2.66%。从结果看出朝谷58号在CCGG位点上的胞嘧啶甲基化主要发生在内侧胞嘧啶上。
2.2.2 豫谷1号的甲基化水平从100对MSAP选扩引物中，选出32对适合于豫谷1号的MSAP引物组合，共扩增产生1 482条清晰可辨且可重复的DNA条带。在全基因组水平上CCGG位点的甲基化比例为8.77%，根据条带类型统计，其中内侧胞嘧啶全甲基化比例为6.41%，半甲基化比例为2.36%，豫谷1号在CCGG位点上的胞嘧啶甲基化也主要发生在内侧胞嘧啶上。
2.2.3 朝谷58号与豫谷1号全基因组甲基化水平的比较分析在计算全基因组CCGG位点上的胞嘧啶甲基化水平后(表 4)，发现朝谷58号的甲基化水平低于豫谷1号，这种甲基化水平的差异是由于两个品种胞嘧啶内侧全甲基化位点差异造成的。同时，两个品种的胞嘧啶内侧全甲基化水平均高于单链半甲基化水平，说明在谷子基因组中这种对称性的胞嘧啶内侧全甲基化位点是甲基化修饰的主要形式。此外，单链胞嘧啶半甲基化水平在两个品种中没有明显差异。仪治本等[21]在运用MSAP技术研究玉米杂交种及其亲本基因组DNA胞嘧啶甲基化水平中，其选用的第一组亲本Mo 17与Suwan 5的全甲基化水平分别为17.1%和24.4%，第二组亲本Suwan 1与太3221的全甲基化水平分别为24.6%和21.6%，与本实验的研究结果相同，说明同种作物的不同品种之间的全甲基化水平也不同。
3 讨论DNA甲基化在植物的生长发育中具有重要意义，甲基化的变化会影响农作物的表型、花期和产量[22-23]。另外，Zhong等研究表明在番茄果实成熟过程中DNA甲基化的变化发挥重要作用[24]。本研究通过100对引物组合筛选获得32对有效的引物组合，检测两个谷子品种在CCGG位点DNA甲基化水平。朝谷58号和豫谷1号分别检测到1 615条和1 482条条带，但由于MSAP技术使用的限制性内切酶只能识别和切割CCGG序列，对其他位点的甲基化不能检测，其检测位点具有局限性，所以对于基因组中实际甲基化水平评估偏低[20]，即实验数据得到朝谷58号和豫谷1号全基因组CCGG序列胞嘧啶甲基化所占的比例为6.93%和8.77%，要低于谷子两个品种各自的甲基化水平。Xiong等在研究水稻杂交种及其亲本的甲基化模式中发现，其中亲本Zhenshan 97和Minghui 63的胞嘧啶甲基化水平基本相同为16.3%，而杂交后代的Shanyou 63的胞嘧啶甲基化水平低于两种亲本，说明其杂交后代和亲本之间的甲基化水平也会存在差异[25]。谷子不同品种间的甲基化差异可能是其表型和性状差异原因，这种差异可以为培育新型的谷子品种提供表观遗传学方向的思路。
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