8月1日，清华大学生命科学学院李雪明课题组在《结构生物学报》（Journal of Structural Biology）期刊发表了题为“在聚焦离子束切割过程中使用细胞二次电子成像实时定位细胞结构”（Locating cellular contents duringcryoFIBmilling using cellular secondary-electron imaging）的研究论文。该论文利用细胞二次电子成像（CESI）技术，解决了聚焦离子束（FIB）切割样品中的定位问题（图1）。该技术基于双束电镜中扫描电镜基本的成像方式，无需额外的设备，样品也无需经过任何处理即可实现。该工作讨论了CSEI技术的成像原理，优化了CSEI的成像设置，使其可在主流的双束电镜上应用，并且经过测试，该方法在不同的切割条件下都是可信赖的。
图1.CESI技术的工作流程
研究团队针对FIB减薄样品过程中的定位问题，想要开发一种容易操作、普适性的方法。受到层扫技术的启发，研究团队想到利用扫描电镜所成的高衬度的图像进行定位。在冷冻状态下，扫描电镜主要利用二次电子进行成像，在默认状态下，二次电子像被用来观察样品的形貌（图2a），辅助切割。而对于FIB切割出来的平面，二次电子像只能看到模糊的细菌轮廓（图2b）。为此，该工作对于二次电子像的成像原理进行探究，并对影响二次电子像成像的因素进行了一一测试，包括电压加速、电流、探测器、成像模式、驻留时间、工作距离、扫描次数等。最终，总结出了在市面上主流FIB中都适用的参数，使得不同仪器上的二次电子像都能有很好的衬度（图3）。
图2.默认状态下利用扫描电镜观察样品形貌（左）与FIB减薄后的平面（右）
图3.大肠杆菌细胞使用不同FIB设备成像细胞二次电子像均能有很好的衬度
为了验证利用CESI技术进行定位的可行性，该工作将CESI技术应用到不同类型的样品上，包括细菌、单细胞真核生物衣藻、人皮肤鳞癌细胞、海拉细胞、和动植物组织（图4），发现均能有很好的成像效果。同时，研究团队发现，在不同切割的条件下，包括在样品表面有冰渣的情况下以及大束流的切割条件下，不会影响CSEI技术的使用。
图4.不同类型的样品在CSEI技术下的成像效果
最后，该研究以衣藻的基体（basal body）为定位对象，建立了简单的切割-定位流程。使用CSEI技术定位时，从样品单侧进行减薄，每次FIB减薄后，都使用CSEI技术进行定位。CSEI技术可以实现在切割过程中进行持续实时成像和精确三维定位。
清华大学生命科学学院李雪明副教授为本文通讯作者。清华大学生命科学学院2018级博士生林超（已毕业）、生命学院博士后张立、生命学院2021级博士生张子颖、蔡司显微镜北京客户中心工程师蒋艺丰为该论文的共同第一作者。清华大学博士研究生王思涵（已毕业），清华大学周珩博士、赵雅娴博士，以及潘俊敏教授实验室博士研究生王正茂，李丕龙副教授实验室李如博士为本工作提供了细胞样品；李晓敏博士和李英博士为样品制备和数据收集提供了大力支持。该研究得到国家自然科学基金、清华-北大生命科学联合中心、北京生物结构前沿中心和结构生物学高精尖创新中心的资助。
论文链接：
https://doi.org/10.1016/j.jsb.2023.108005
供稿：生命学院
题图设计：梁晨
编辑：李华山
审核：郭玲
2023年08月16日 10:08:37
