8月1日,清华大学生命科学学院李雪明课题组在《结构生物学报》(Journal of Structural Biology)期刊发表了题为“在聚焦离子束切割过程中使用细胞二次电子成像实时定位细胞结构”(Locating cellular contents duringcryoFIBmilling using cellular secondary-electron imaging)的研究论文。该论文利用细胞二次电子成像(CESI)技术,解决了聚焦离子束(FIB)切割样品中的定位问题(图1)。该技术基于双束电镜中扫描电镜基本的成像方式,无需额外的设备,样品也无需经过任何处理即可实现。该工作讨论了CSEI技术的成像原理,优化了CSEI的成像设置,使其可在主流的双束电镜上应用,并且经过测试,该方法在不同的切割条件下都是可信赖的。
![](https://www.tsinghua.edu.cn/__local/A/92/11/BD8BA2C167762272DB013A5A64F_A9DC15C4_F3500.png)
图1.CESI技术的工作流程
研究团队针对FIB减薄样品过程中的定位问题,想要开发一种容易操作、普适性的方法。受到层扫技术的启发,研究团队想到利用扫描电镜所成的高衬度的图像进行定位。在冷冻状态下,扫描电镜主要利用二次电子进行成像,在默认状态下,二次电子像被用来观察样品的形貌(图2a),辅助切割。而对于FIB切割出来的平面,二次电子像只能看到模糊的细菌轮廓(图2b)。为此,该工作对于二次电子像的成像原理进行探究,并对影响二次电子像成像的因素进行了一一测试,包括电压加速、电流、探测器、成像模式、驻留时间、工作距离、扫描次数等。最终,总结出了在市面上主流FIB中都适用的参数,使得不同仪器上的二次电子像都能有很好的衬度(图3)。
![](https://www.tsinghua.edu.cn/__local/5/C9/03/725107C2B419C16A32526FC2695_CACC94CE_5D707.png)
图2.默认状态下利用扫描电镜观察样品形貌(左)与FIB减薄后的平面(右)
![](https://www.tsinghua.edu.cn/__local/F/63/74/495ABC16F29338A252D92894ACE_BC2B0ABA_A73AD.png)
图3.大肠杆菌细胞使用不同FIB设备成像细胞二次电子像均能有很好的衬度
为了验证利用CESI技术进行定位的可行性,该工作将CESI技术应用到不同类型的样品上,包括细菌、单细胞真核生物衣藻、人皮肤鳞癌细胞、海拉细胞、和动植物组织(图4),发现均能有很好的成像效果。同时,研究团队发现,在不同切割的条件下,包括在样品表面有冰渣的情况下以及大束流的切割条件下,不会影响CSEI技术的使用。
![](https://www.tsinghua.edu.cn/__local/8/61/76/85B1825D7787CDA43CBFEC9CF83_1FBFCBDF_16079B.png)
图4.不同类型的样品在CSEI技术下的成像效果
最后,该研究以衣藻的基体(basal body)为定位对象,建立了简单的切割-定位流程。使用CSEI技术定位时,从样品单侧进行减薄,每次FIB减薄后,都使用CSEI技术进行定位。CSEI技术可以实现在切割过程中进行持续实时成像和精确三维定位。
清华大学生命科学学院李雪明副教授为本文通讯作者。清华大学生命科学学院2018级博士生林超(已毕业)、生命学院博士后张立、生命学院2021级博士生张子颖、蔡司显微镜北京客户中心工程师蒋艺丰为该论文的共同第一作者。清华大学博士研究生王思涵(已毕业),清华大学周珩博士、赵雅娴博士,以及潘俊敏教授实验室博士研究生王正茂,李丕龙副教授实验室李如博士为本工作提供了细胞样品;李晓敏博士和李英博士为样品制备和数据收集提供了大力支持。该研究得到国家自然科学基金、清华-北大生命科学联合中心、北京生物结构前沿中心和结构生物学高精尖创新中心的资助。
论文链接:
https://doi.org/10.1016/j.jsb.2023.108005
供稿:生命学院
题图设计:梁晨
编辑:李华山
审核:郭玲
2023年08月16日 10:08:37