, 梁雪芳
, 李霞, 杨慧婷, 郭伟内蒙古大学生态与环境学院, 内蒙古自治区环境污染控制与废物资源化重点实验室, 呼和浩特 010021
收稿日期: 2020-11-05; 修回日期: 2020-12-09; 录用日期: 2020-12-09
基金项目: 国家自然科学基金（No.21866024）；内蒙古自治区自然科学基金（No.2020MS02003）；内蒙古大学校级大学生创新创业训练计划项目（No.202017400）
作者简介: 刘旺(1997-),男,E-mail:liuwang970126@163.com
通讯作者（责任作者）: 梁雪芳(1987—), 女, 博士, 副教授, 硕士生导师, 主要研究方向为水生态毒理学.E-mail: liangxf@imu.edu.cn
摘要：2，4-二叔丁基苯酚（2，4-di-tert-butylphenol，2，4-DTBP）作为一种合成酚类抗氧化剂（Synthetic Phenolic Antioxidants，SPAs）被广泛应用于塑料、橡胶、食品等工业产品中，近年来在水体、空气、生物体中被不同程度检出.然而目前有关2，4-DTBP的毒理学研究十分有限，尤其是对鱼类早期发育阶段的神经毒性效应尚未可知.因此，本文以斑马鱼为研究对象，在涵盖环境相关浓度水平上（0.01、0.1和1 μmol·L-1，即2.06、20.6和206 μg·L-1），从运动活性、焦虑行为及多巴胺和5-羟色胺神经信号通路的基因转录水平探讨2，4-DTBP对斑马鱼早期发育阶段的神经毒性效应及其作用机制.结果发现，0.01和0.1 μmol·L-1 2，4-DTBP暴露引起仔鱼在暗周期过度活跃，1 μmol·L-1 2，4-DTBP暴露引起仔鱼在光周期异常平静及焦虑行为，斑马鱼的行为异常可能与5ht1ab和drd1的过度表达有关.研究表明，2，4-DTBP可能对斑马鱼早期发育阶段具有神经毒性，且不同剂量下的作用机制不同.
关键词：2,4-DTBP运动活性焦虑行为多巴胺通路5-羟色胺通路
Neurotoxicity of 2,4-di-tert-butylphenol on the early-staged zebrafish
LIU Wang
, LIANG Xuefang, LI Xia, YANG Huiting, GUO WeiInner Mongolia Key Laboratory of Environmental Pollution Control & Waste Resource Reuse, School of Ecology and Environment, Inner Mongolia University, Hohhot 010021
Received 5 November 2020; received in revised from 9 December 2020; accepted 9 December 2020
Abstract: 2,4-RRdi-RRtert-RRbutylphenol, a typical synthetic phenolic antioxidant, has been widely used in industrial products such as plastics, rubber, and food. In recent years, 2,4-DTBP has been detected in water, air, and organisms. However, the neurotoxicity of 2,4-DTBP and the underlying mechanisms were not well documented. In this study, zebrafish embryos were exposed to 0.01, 0.1, and 1 μmol·L-1 (equal 2.06, 20.6, and 206 μg·L-1) 2,4-DTBP for 6 days. After exposure, locomotion behavior in dark photokinesis test and light-dark preference test, as well as the expression of genes related to dopamine signaling and serotonin signaling were performed to investigate the toxic effects of 2,4-DTBP in zebrafish larvae. Results showed that 0.01 and 0.1 μmol·L-1 2,4-DTBP could induce hyperactivity of zebrafish larvae in dark period in dark photokinesis test, which may be related to the over-expression of 5ht1ab and drd1. However, 1 μmol·L-1 2,4-DTBP could cause slightly anxiety-like activity in larvae in light-dark preference test, which might be induced by the up-regulation of drd1. In summary, 2,4-DTBP might cause neurotoxicity in early-staged zebrafish, while the toxic mechanism is dose-dependent.
Keywords: 2,4-DTBPlocomotor behavioranxiety-like activitydopamine signalingserotonin signaling
1 引言(Introduction)合成酚类抗氧化剂(Synthetic Phenolic Antioxidants, SPAs)是一类延缓材料氧化降解的物质, 在食品包装、塑料、石油化工及个人护理品等工商业产品中有广泛应用(Lu et al., 2019).2,4-二叔丁基苯酚(2,4-di-tert-butylphenol, 2,4-DTBP)作为一种典型的SPAs, 结构上属烷基酚, 除直接用于抗氧化添加剂外, 还是合成紫外稳定剂及大分子类抗氧化剂(如抗氧化剂168)的重要化学中间体(L?schner et al., 2011).因使用广泛, 2,4-DTBP已被美国、欧盟列入“高产量化学品名录(High Production Volume, HPV)”, 2017年全球产量约为4500 ~ 20000 t (Lu et al., 2019).
由于2,4-DTBP在使用过程中不与聚合物共价结合, 因此, 易从基体中释放到各类环境介质中, 如灰尘(Maceira et al., 2019)、土壤(Remberger et al., 2004)、地表水(Tang et al., 2015; Wang et al., 2018)、污水污泥(Lu et al., 2019)、饮用水(Liu et al., 2016)等.另外, 作为多酚类抗氧化剂168的降解产物, 2,4-DTBP亦可随塑料碎片的降解进入环境(Rani et al., 2015; 2017).近年来, 2,4-DTBP在水环境中被频繁检出, 地表水中2,4-DTBP浓度水平为ng·L-1~μg·L-1, 我国长沙捞刀河中2,4-DTBP浓度甚至高达300 μg·L-1(Tang et al., 2015).而在污水处理厂中, 2,4-DTBP也是主要的SPAs之一, 如在加拿大的12处污水处理厂的污泥中2,4-DTBP检出率为100%, 平均含量为341 ng·g-1(Lu et al., 2019).
2,4-DTBP的脂溶性较高(logKow=5.3), 具有潜在的生物富集性, 易富集于肝脏和脂肪组织.如Rizzo等(2017)在意大利海洋保护区内的鲷鱼肝脏中检测到2,4-DTBP, 含量为0.8~6.8 ng·g-1.Acharya等(2019)报道2,4-DTBP在母乳样本中的检出率为98%, 其中, 肥胖组人群的平均检出量为(3569±8358) ng·g-1, 高于正常组的含量((2380 ± 5255) ng·g-1).Liu和Mabury(2019)发现2,4-DTBP在人体尿液中的含量高达18.3 μg·L-1, 远高于其他SPAs.此外, 2,4-DTBP在水中的半衰期约为900 h(Lu et al., 2019), 其潜在的持久性也可能对有机体造成不利影响.
毒理学方面, 2,4-DTBP暴露28 d后对新生大鼠和幼鼠的肝、肾均产生不良影响(Hirata-Koizumi et al., 2005)；2,4-DTBP对莱茵衣藻生长及总叶绿素含量有显著抑制作用, 并呈现出浓度-时间依赖性(Wang et al., 2018).此外, 2,4-DTBP可能具有内分泌干扰效应, 之前研究表明, 2,4-DTBP对虹鳟鱼肝细胞具有抗雌激素效应(Akahori et al., 2008; Tollefsen et al., 2008).Wang等(2018)在体外受体结合实验发现, 2,4-DTBP对人体雌激素受体、雄激素受体及甲状腺激素受体均表现为拮抗效应.然而目前有关2,4-DTBP的毒性研究十分有限, 尤其是对鱼类早期发育阶段的神经毒性效应尚未可知.
改变斑马鱼早期生命阶段的运动行为已被用来评估化学物质的发育神经毒性(Liang et al., 2019).基于此, 本研究以斑马鱼为模式生物, 在涵盖2,4-DTBP环境相关浓度水平上(0.01、0.1和1 μmol·L-1, 即2.06、20.6和206 μg·L-1), 分析斑马鱼仔鱼行为参数的改变, 验证多巴胺(dopamine)和5-羟色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT, 即血清素, serotonin)两条重要的神经信号通路中的关键基因, 尝试探究个体行为的变化是否与多巴胺和血清素通路的关键基因表达量变化有关, 初步探讨2,4-DTBP对斑马鱼早期发育阶段的神经毒性.
2 材料与方法(Materials and methods)2.1 实验动物野生AB型斑马鱼饲养于内蒙古大学生态与环境学院的流水养殖系统(海圣, 上海).水温控制在(28.0±1.0) ℃, 光周期为14 h∶10 h (昼/夜), pH=7.2±1.0, 电导率为500 μS·cm-1, 每天投喂丰年虾活体(Artemia naupli)2次.
2.2 实验材料及仪器所用试剂包括2,4-二叔丁基苯酚(CAS号：96-76-4；纯度>98%；梯希爱, 日本)、二甲基亚砜(DMSO)(CAS号：67-68-5；纯度>99%；Sigma, 美国)、TRIzol试剂(Life Technologies, 美国)、Takara反转录试剂盒(PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser, 日本)、Takara荧光定量PCR试剂盒(TB Green Premix Ex Taq II, 日本).
所用仪器包括体视解剖显微镜(Olympus SZX2-ILLB, 日本)、斑马鱼行为分析系统(Noldus DanioVision, 荷兰)、荧光定量PCR仪(CFX96TM Real Time PCR Detection System, BioRad, 美国).
2.3 实验方法2.3.1 胚胎收集与暴露实验前一晚随机选取健康斑马鱼放入产卵缸中(雌雄比例为1∶3), 将雌雄鱼用隔板隔开, 水温保持在(28.0±1.0) ℃.次日清晨将隔板取出, 光照刺激下开始追尾产卵.1 h后收集受精卵于无菌培养皿中, 在显微镜下挑选发育健康的胚胎(受精后约6 h, shield阶段)用于暴露实验.
暴露实验方法参考Liang等(2019)的研究.将胚胎置于25 mL烧杯中, 每个烧杯10枚胚胎.烧杯中加入10 mL相应浓度的暴露液, 以0.01、0.1和1 μmol·L-1(2.06、20.6和206 μg·L-1)3个浓度为2,4-DTBP处理组, 以含0.01% DMSO的溶液为对照组(Control), 每个组设置5个平行(n=5).胚胎培养在温度(28.0±1.0) ℃、光暗周期14 h∶10 h的环境中, 半静态暴露6 d, 每24 h更新90%的暴露液.暴露分3个批次进行, 暴露后的仔鱼分别用于光暗交替刺激测试、焦虑行为测试、定量PCR分析.
2.3.2 运动活性监测在96孔板的每个孔中加入300 μL暴露液(0.01% DMSO和0.01、0.1、1 μmol·L-1 2,4-DTBP), 每个浓度设置24个孔(n=24), 随机选取24条同一处理组的仔鱼, 分别转移到96孔培养板中, 每孔1条鱼, 将96孔板置于观察室中, 温度控制在(28.0±1.0) ℃.仔鱼适应20 min后开始记录运动轨迹, 以10 min为一个光/暗周期, 跟踪仔鱼在50 min变化周期(暗-亮-暗-亮-暗)内的游动轨迹.从Etho Vision中生成移动距离等行为数据, 导出作进一步分析.暴躁、活跃及静止状态的划分依据Etho Vision默认设置.
2.3.3 焦虑行为测试焦虑行为采用光暗偏好测试, 具体方法参考Perez-Rodriguez等(2018)的研究, 即在96孔板下方放置一个半黑色半镂空的格栅板, 每孔底部半明半暗；孔板上方再覆盖一块黑色遮光板以防止光线由镂空区进入经摄像头反射至黑暗区；底部光源打开后, 每孔均分成明室与暗室, 将仔鱼置于其中.在Etho Vision软件中命名相应的分析区域(暗区、亮区)进行跟踪和分析, 孔板的浓度设置和仔鱼放置方法同2.3.2节.适应20 min后, 连续光照刺激60 min, 追踪仔鱼运动轨迹并对其进入黑暗区的频率及持续时间进行分析.
2.3.4 实时荧光定量PCR暴露结束后, 将仔鱼收集于1.5 mL离心管中, 每管5条, 液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存.样本总RNA采用Trizol法提取, 除杂后用Nano Drop 2000(Thermo Scientific, 美国)测试样本, 保证1.8 < OD260/280 < 2.0.cDNA反转录依据Takara反转录试剂盒(PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser)说明书进行, 反转录体系RNA添加量为500 ng, 得到的cDNA在以下条件扩增：预变性阶段在95 ℃下进行30 s, 设定1个循环；PCR反应阶段在95 ℃下进行5 s, 引物退火3 s, 设定39个循环；然后溶解曲线分析, 从65 ℃开始, 到95 ℃结束, 每隔5 s增加0.5 ℃.借助CFX ManagerTM软件通过相对ΔΔCq方法计算标准化的基因表达量(Normalized Gene Expression).目的基因引物序列信息如表 1所示.
表 1(Table 1)
| 表 1 目的基因引物序列信息 Table 1 Gene primer sequence information | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
表 1 目的基因引物序列信息 Table 1 Gene primer sequence information
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2.4 数据分析数据分析均在SPSS 22.0中进行.采用Kolmogorov-Smirnov检验数据的正态性, 对不符合正态分布的数据进行转换使其符合正态分布.采用Levene检验数据的方差齐性, 采用Dunnett进行单因素方差分析(One-way ANOVA), 统计检验水平为0.05, 实验数据以平均值±标准误差(Mean±SEM)的方式给出.柱状图由GraphPad Prism 8.0绘制, 雷达图由Sigmaplot 14.0绘制.
3 结果(Results)3.1 光暗交替刺激下2,4-DTBP对斑马鱼仔鱼游动行为的影响经6 d暴露后, 2,4-DTBP对斑马鱼仔鱼的运动活性产生显著影响, 而且光、暗周期的影响不同(图 1、表 2).对光周期内各行为参数进行分析, 结果显示, 与对照组相比, 1 μmol·L-1 2,4-DTBP暴露下的仔鱼在光周期内的游动距离虽未产生显著性差异, 但加速度显著下降(F(3, 188)=4.815, p=0.003)(图 1a、表 2)；此外, 进入暴躁期的频率(F(3, 188)=7.051, p=0.0002)及处于暴躁期的时间(F(3, 188)=6.829, p=0.0002)均显著下降, 其他活动状态下的行为参数未见显著性差异(表 2).在暗周期内, 0.01 μmol·L-1和0.1 μmol·L-1 2,4-DTBP暴露下的仔鱼游动距离(F(3, 188)=11.43, p < 0.0001)及处于活跃期的时间(F(3, 188)=11.50, p < 0.0001)均显著上升(图 1b、表 2)；此外, 0.1 μmol·L-1 2,4-DTBP暴露下的仔鱼处于暴躁期的时间(F(3, 188)=2.483, p=0.0622)显著上升, 处于静止期的时间(F(3, 188)=9.461, p < 0.0001)显著下降(表 2).
图 1(Fig. 1)
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| 图 1 2,4-DTBP暴露6 d对斑马鱼仔鱼运动活性的影响 (a.光周期下斑马鱼仔鱼游动行为变化的雷达图, b.暗周期下斑马鱼仔鱼游动行为变化的雷达图) Fig. 1Zebrafish larvae in dark-phototaxis activity (a.locomotor behavior of zebrafish larvae in light periods, b.locomotor behavior of zebrafish larvae in dark periods) |
表 2(Table 2)
| 表 2 2,4-DTBP对斑马鱼仔鱼(6 d)光/暗周期游动行为的影响 Table 2 Variations of parameters indicating locomotion of zebrafish larvae in dark-phototaxis test | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
表 2 2,4-DTBP对斑马鱼仔鱼(6 d)光/暗周期游动行为的影响 Table 2 Variations of parameters indicating locomotion of zebrafish larvae in dark-phototaxis test
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3.2 2,4-DTBP对斑马鱼仔鱼焦虑行为的影响为了进一步评价2,4-DTBP对斑马鱼早期发育阶段的神经毒性, 对暴露后仔鱼的焦虑行为进行了分析(图 2).结果显示, 在60 min观察期间2,4-DTBP暴露后的仔鱼每分钟进入暗区的频率及停留在黑暗区域的时间与对照组未见明显分离趋势(图 2a、2c).以15 min为时间间隔作进一步分析, 结果显示, 在0~15 min, 1 μmol·L-1 2,4-DTBP暴露下的仔鱼进入黑暗区域的频率(F(3, 92)=2.982, p=0.0354)及在黑暗区域的停留时间(F(3, 92)=2.929, p=0.0378)与对照组相比均显著下降, 其余浓度未见显著性差异；其余时间段各暴露浓度与对照组相比无显著性差异(图 2b、2d).
图 2(Fig. 2)
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| 图 2 2,4-DTBP暴露对斑马鱼仔鱼 (6 d)焦虑行为测试(a.仔鱼每分钟进入暗区的频率, b.仔鱼每15 min进入暗区的频率, c.仔鱼每分钟停留在黑暗区域的累积持续时间, d.仔鱼每15 min在暗区的累积停留时间) Fig. 2Anxiety-like behavioral analysis of zebrafish larvae exposed to 0.01, 0.1, and 1 μmol·L-1 2,4-DTBP for 6 days(The analyzed parameters included cumulative duration (s) that larval zebrafish stay in dark zone per minute intervals(a); Group mean of the cumulative duration per 15-min intervals in different concentrations of 2,4-DTBP(b); Frequency of the dark zone visiting during experiment per minute intervals(c), or per 15-min intervals(d)) |
3.3 2,4-DTBP对斑马鱼仔鱼多巴胺和血清素通路的影响为在分子水平上进一步探究2,4-DTBP引起斑马鱼运动活性及焦虑行为变化的原因, 研究了仔鱼多巴胺和5-羟色胺通路关键基因在暴露前后的表达(图 3、图 4). 对4个多巴胺通路相关基因表达量(dat、drd1、drd2a、drd3)进行验证, 结果如图 3所示.由图可知, 仅drd1表达量出现显著差异, 其余基因表达量无显著影响.在0.1 μmol·L-1和1 μmol·L-1 2,4-DTBP暴露下, 斑马鱼仔鱼体内drd1含量分别显著上调了1.41倍(p=0.0138)和1.37倍(p=0.0245)(图 3b).
图 3(Fig. 3)
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| 图 3 2,4-DTBP暴露对斑马鱼仔鱼(6 d)多巴胺通路基因的影响 Fig. 3The expression of dopamine genes for zebrafish larvae (6 d) after 2,4-DTBP exposure |
图 4(Fig. 4)
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| 图 4 2,4-DTBP暴露对斑马鱼仔鱼(6 d)5-羟色胺通路基因的影响 Fig. 4The expression of serotonin genes for zebrafish larvae (6 d) after 2,4-DTBP exposure |
对6个5-羟色胺通路的基因相对表达量(5ht1aa、5ht1ab、5ht1b、5ht2c、mao、serta)进行验证, 结果表明, 仅5ht1ab的表达量在0.01 μmol·L-1 2,4-DTBP暴露下显著上调1.64倍(p=0.0319)(图 4b), 其余基因表达量未见显著变化.
4 讨论(Discussion)4.1 2,4-DTBP引起仔鱼异常活跃和类似焦虑行为有无光照可使斑马鱼仔鱼产生不同的行为.光照中的仔鱼运动平稳, 而黑暗中的仔鱼运动活性增加, 该行为与其他指标相比有高度稳定性(Fitzgerald et al., 2019).因此, 根据仔鱼在光/暗周期的运动参数变化可充分反映仔鱼运动活性(Shontz et al., 2018).在暗周期内, 0.01和0.1 μmol·L-1 2,4-DTBP暴露下的仔鱼游动距离及活跃时间显著上升, 表明该浓度下斑马鱼仔鱼过度活跃, 而1 μmol·L-1的2,4-DTBP暴露下仔鱼在暗周期的游动距离等各项行为指标无显著性差异, 表明不同浓度2,4-DTBP对仔鱼的作用方式可能不同.先前研究也出现类似结果, 如Shontz等(2018)将5 d斑马鱼仔鱼暴露于10 μmol·L-1潘多立酮24 h后进行运动活性测试, 发现仔鱼在暗周期的移动距离显著上升(F(2, 27)=15, p < 0.0001).Irons等(2010)研究发现, 0.2 μmol·L-1的安他非命可引起6 d斑马鱼仔鱼在暗周期的游动距离显著上升, 而高浓度安他非命(6.6和20 μmol·L-1)导致仔鱼暗周期内游动距离显著降低, 随着暴露浓度增加, 仔鱼的运动活性并未表现出明显的剂量-效应关系.在光周期内, 2,4-DTBP会显著影响仔鱼游动距离, 与Shontz等(2018)和Irons等(2010)的结果一致.但1 μmol·L-1 2,4-DTBP暴露下仔鱼的加速度、暴躁时间及暴躁频率与对照组相比均显著下降, 可能暗示仔鱼在光照状态下的行为“异常平静”.本研究结果同时表明, 暴躁时间及频率可能是比游动距离更为敏感的毒性响应指标, 这需要进一步研究.
斑马鱼仔鱼对暗区和光区的偏好选择性可反映其焦虑行为(Steenbergen et al., 2011).药理学研究证明, 致焦虑药物会增加仔鱼避暗行为(进入暗区的频率和时间显著降低), 而抗焦虑药物的作用与之相反(Steenbergen et al., 2011).Liang等(2019)将仔鱼暴露于2, 6-二叔丁基对甲酚中7 d, 发现在0.01 μmol·L-1暴露组的仔鱼避暗行为显著降低(处于暗区的时间均显著增加), 表现为抗焦虑行为, 而0.1 μmol·L-1暴露组的仔鱼避暗行为显著增加, 表现为焦虑行为, 1 μmol·L-1暴露组的仔鱼在0~15 min表现为焦虑行为, 15~30 min表现为抗焦虑行为, 其余时间段无显著变化, 作者推测这是由于不同的剂量和作用时间对神经递质的影响不同, 进而导致仔鱼行为的紊乱性.相比之下, 2,4-DTBP对仔鱼焦虑行为的影响较为轻微和短暂, 仅1 μmol·L-1的仔鱼在前15 min的避暗行为显著上升, 而其余浓度和时间段内的数据未见统计学差异.
4.2 2,4-DTBP引起drd1和5ht1ab过量表达斑马鱼仔鱼行为的神经回路已被证实与视网膜、5-羟色胺及多巴胺等因素密切相关(Burgess et al., 2010; Mclean et al., 2010).在Severi等(2014)提出的斑马鱼仔鱼以“内侧纵束核(Nucleus of the Medial Longitudinal Fasciculus, nMLF)”为中心的运动神经回路中, 视网膜接收的感觉信号通过脑部的视前盖传递至nMLF, 后者进行信号处理并传递至脊髓, 脊髓内的神经元被激活从而引发运动, 而存在于脑中部的多巴胺和5-羟色胺都可调控nMLF的活动.由此可见, 多巴胺和5-羟色胺在调节仔鱼运动方面有不可忽略的作用.为此, 本研究选择与5-羟色胺和多巴胺通路有关的基因, 进一步验证2,4-DTBP对斑马鱼仔鱼的分子响应.
在斑马鱼的5-羟色胺通路中, 5-HT通过囊泡单胺转运体(Vesicular Monoamine Transporter, VMAT)进行贮存和循环或由单胺氧化酶(Monoamine Oxidase, MAO)降解(Cunha et al., 2017), 释放到细胞间隙的5-HT可通过相应受体(5HT1A、5HT1B、5HT2C)将活性传递到目标神经元, 从而传播神经递质信号, 也可被突触前膜的血清素转运体(Serotonin Reuptake Transporters, SERT)再摄取(Pei et al., 2016).根据荧光定量结果, 0.01 μmol·L-1 2,4-DTBP暴露下仔鱼在暗周期的异常活跃可能与5ht1ab的过量表达有关.5ht1ab的表达量显著上升, 意味着5HT1A受体增加, 靶神经元接触并传递的5-HT增加, 导致神经元兴奋性增加.Rihel等(2010)将4 dpf(days post-fertilization, dpf)的仔鱼暴露在10和30 μmol·L-1丁螺环酮(激动剂)中发现其活动时间增加.类似地, 暴露于6.25 mg·L-1丁螺环酮5 min后, 成年斑马鱼在新水箱底层潜伏时间显著降低, 表现出高运动活性(Levin, 2009).Pei等(2016)将斑马鱼胚胎暴露于1和10 μmol·L-1氟西汀3 d后再净化3 d, 测试仔鱼自发游泳的活性, 结果表明, 仔鱼游动距离显著下降, 同时5ht1ab表达量受到抑制, 作者认为这是由于氟西汀作为血清素再摄取抑制剂, 导致细胞外5-HT浓度上升, 为维持正常的血清素信号进而抑制突触后5ht1ab表达, 造成突触后5-HT1A受体减少, 净化期间尽管氟西汀暴露已停止, 然而由于突触后可接受的5-HT减少, 最终引起仔鱼的活跃性降低.另一项实验使用4.6 μmol·L-1的氟西汀将5 dpf的仔鱼暴露24 h后连续观测9 d游泳行为, 结果同样降低了仔鱼活跃性, 并进一步确定脊髓中的5ht1aa表达量显著下降(Airhart et al., 2007).Parker等(2014)将仔鱼暴露于20 mmol·L-1乙醇中7 d, 结果显示, 暴露结束后5ht1aa表达量显著下降, 同时观测到成鱼的个体社交行为和聚群行为均显著下降, 并认为这是由于5-HT1A受体减少所致.
在斑马鱼的多巴胺信号通路中, VMAT将多巴胺转运到囊泡中, 释放至细胞间隙后, 进而与受体(D1类、D2类)结合, 也可被突触前的多巴胺转运体(Dopamine Transporter, DAT)转运至胞浆分解, drd1转录表达的D1类多巴胺受体为突触后受体, 接收多巴胺后, 对神经传递有兴奋性作用(Souza et al., 2011).本研究中, 0.1 μmol·L-1 2,4-DTBP暴露引起drd1表达量显著上调, 这可能引起突触后D1受体的激活, 导致有更多的多巴胺被传递, 增强神经递质的兴奋性, 从而导致仔鱼在暗周期的异常活跃行为.Irons等(2013)探究了D1类多巴胺受体拮抗剂和激动剂在亚致死浓度(0.2~50 μmol·L-1)下对6 d斑马鱼仔鱼光暗交替刺激的影响, 结果显示, D1类受体激动剂(SKF-38393)可显著提高仔鱼在黑暗条件下的游动距离, 而SCH-23390(D1类受体选择性拮抗剂)效应与之相反.Tran等(2015)也证实暴露于SCH-23390(1.0 mg·L-1) 30 min后可导致成年斑马鱼的总游动距离显著下降(p=0.046)而休眠时间显著上升(p=0.028).Shontz等(2018)发现10 μmol·L-1多潘立酮暴露可引起斑马鱼仔鱼在黑暗中变得异常活跃, 并推测可能是包括drd1在内的多巴胺受体基因的过量表达所致.
与0.1 μmol·L-1浓度组不同, 1 μmol·L-1 2,4-DTBP暴露虽然也引起drd1的表达量显著上调, 但仔鱼在运动活性监测的暗周期中并未表现出异常的活跃行为, 而是在焦虑行为测试的0~15 min出现短暂的焦虑行为(避暗行为显著增加).早前研究中, Le-Niculescu等(2011)发现致焦虑药物可导致小鼠的drd1过量表达并引起焦虑行为, 进而将drd1列为验证焦虑行为的候选基因.Ferraro等(2002)将成年斑马鱼暴露于2~200 mg·L-1的D1受体拮抗剂莫达芬尼30 min, 发现所有浓度暴露后的斑马鱼在陌生环境中的焦虑行为显著下降.这些研究表明, 1 μmol·L-1 2,4-DTBP对仔鱼运动活性和焦虑行为的影响机制与低浓度组不同, 需要进一步研究.
通常认为, 多巴胺调节斑马鱼的运动活性, 5-羟色胺调节斑马鱼的焦虑行为, 但已有研究发现二者作用并非相互独立(Tran et al., 2016).Tran等(2016)发现5-羟色胺通路的变化仅部分介导斑马鱼的焦虑反应, 多巴胺通路也可能与焦虑行为相互作用或促成焦虑相关的行为.运动活性虽然与多巴胺系统有关, 但诱发焦虑和/或恐惧的刺激也可能调节运动, 而这些刺激均与5-羟色胺相关.此外, 已有研究证明大部分血清素调节药物对非血清素受体有相当大的亲和力, 特别是多巴胺和肾上腺素受体等(Rihel et al., 2010), 这种药物的多通路作用也增加了结果的复杂性和分析的困难性.
5 结论(Conclusions)通过运动活性监测和焦虑行为测试, 发现不同浓度的2,4-DTBP均可以引起斑马鱼仔鱼的异常活跃或者类似焦虑行为, 同时, 5-羟色胺和多巴胺通路相关基因表达结果表明5ht1ab和drd1的过量表达可能与仔鱼行为异常相关.然而, 行为变化背后的神经响应机制是高度复杂的, 今后还需要进一步的研究阐释2,4-DTBP对斑马鱼早期发育阶段的神经毒性效应机制.
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