, 隋倩雯1,2, 陈彦霖1,2, 魏源送1,2,3
, 陈梅雪1,2, 王红艳1,21. 中国科学院生态环境研究中心, 环境模拟与污染控制国家重点联合实验室, 北京 100085;
2. 中国科学院生态环境研究中心, 水污染控制实验室, 北京 100085;
3. 中国科学院大学, 北京 101408
收稿日期: 2020-09-19; 修回日期: 2020-11-23; 录用日期: 2020-11-23
基金项目: 国家水体污染控制与治理科技重大专项（No.2017ZX07102，2017ZX07102-003）；国家自然科学基金（No.21607167）；国家重点研发计划（No.2016YFD0501405）
作者简介: 岳文慧(1995-), 女, 博士研究生, E-mail:wenhui_yue@163.com
通讯作者（责任作者）: 魏源送(1969—), 男, 博士, 研究员, 博士生导师, 主要研究领域为污水处理与再生利用、污泥处理与处置、河流生态治理等. E-mail:yswei@rcees.ac.cn
摘要：一体式部分亚硝化-厌氧氨氧化（CPNA）工艺的脱氮性能常因亚硝酸盐氧化菌（NOB）大量增殖导致的NO3--N积累而恶化.本研究通过连续试验考察长期低剂量投加羟胺（NH2OH）对CPNA工艺原位恢复及其长期运行稳定性的影响.结果表明，低剂量投加NH2OH（1.5 mg·L-1）可快速原位恢复CPNA工艺，TN去除率在45 d内从18.6%恢复至82.2%，ΔNO3--N/ΔNH4+-N比值从0.73±0.05下降至0.13±0.03；以相同方式在100 d内持续投加NH2OH，CPNA工艺的TN去除率长期保持在82.2%±4.9%，ΔNO3--N/ΔNH4+-N比值可长期稳定在0.13±0.03.16S rRNA高通量测序结果表明，羟胺投加期间，脱氮功能菌群变化显著，Nitrospira的丰度从28.22%下降到2.74%，厌氧氨氧化菌Candidatus Kuenenia丰度从初始的3.43%明显增长到22.86%.低剂量投加羟胺可有效促进CPNA工艺的快速原位恢复，并保持其长期稳定运行.
关键词：羟胺总氮去除率部分亚硝化/厌氧氨氧化微生物群落结构
Effects of dosing hydroxylamine on in-situ recovery and operational stability of the combined partial nitritation and anammox process (CPNA)
YUE Wenhui1,2,3
, SUI Qianwen1,2, CHEN Yanlin1,2, WEI Yuansong1,2,3, CHEN Meixue1,2, WANG Hongyan1,21. State Key Joint Laboratory of Environment Simulation and Pollution Control, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085;
2. Laboratory of Water Pollution Control, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085;
3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 101408
Received 19 September 2020; received in revised from 23 November 2020; accepted 23 November 2020
Abstract: The nitrogen removal performance of the combined partial nitritation and anammox process (CPNA) was often deteriorated seriously by the nitrate build-up caused by the proliferation of nitrite oxidizing bacteria (NOB). In this study, a deteriorated sequencing batch reactor (SBR) was used and NH2OH dosing with an initial concentration of 1.5 mg·L-1 was carried out daily. TN removal efficiency increased from 18.6% to 82.2% within 45 d. ΔNO3--N/ΔNH4+-N, as the critical parameter of the CPNA process reduced from 0.73±0.05 to 0.13±0.03. With the continuous dosing of NH2OH in 100 days, TN removal rate and ΔNO3--N/ΔNH4+-N values have been maintained at 82.2%±4.9% and 0.13±0.03 respectively, close to the optimal value with little fluctuation during the long operational period. High-throughput sequencing results of 16S rRNA showed that the microbial community structure changed significantly, the abundance of Nitrospira decreased from 28.22% to 2.74%, and the abundance of Candidatus Kuenenia increased significantly from 3.43% to 22.86%. This study verified the good performance of long-term but low dose of hydroxylamine (NH2OH) on both rapid recovery and operational stability of the CPNA process.
Keywords: hydroxylaminenitrogen removal ratepartial nitritation/Anammoxmicrobial community structure
1 引言(Introduction)厌氧氨氧化工艺是近年来发展较快且最有前景的新型生物脱氮技术, 相较于传统脱氮工艺, 其具有无需投加碳源、节省曝气能耗、剩余污泥产量少等优点, 在处理高氨氮、低C/N比废水时具有显著优势.然而, 实际工程中发现亚硝酸盐氧化细菌(Nitrite Oxidizing Bacteria, NOB)过量繁殖引起的NO3--N累积、脱氮效果恶化的问题, 现有恢复策略存在种泥获取困难、恢复时间过长、运行成本和能耗增加及运行难度增大等不足(Wang et al., 2015).
羟胺(NH2OH)是氨氧化反应的中间产物, 具有抑制NOB和促进亚硝化的作用.已有研究表明, 间歇高剂量NH2OH投加策略可原位恢复厌氧氨氧化工艺处理污泥厌氧消化液(Wang et al., 2016)或城市污水(Li et al., 2018)过程的稳定亚硝化.NH2OH投加剂量为8.25~20 mg · L-1时, 存在引起污泥絮体破碎的风险(Harper et al., 2009).NH2OH投加的短期恢复效果较好, 但由于厌氧氨氧化菌生长缓慢, 短期恢复后微生物群落结构未达到平衡状态(Kang et al., 2019), 停止投加NH2OH后的脱氮效果不稳定.例如, Wang等(2015)以20 mg · L-1的剂量投加羟胺, 停止投加27 d后, 厌氧氨氧化菌的生长速率从0.20 d-1下降至0.007 d-1；李佳等(2019)以10 mg · L-1的剂量投加羟胺, 停止投加20 d后, 脱氮效果显著恶化, NOB活性从3.5 mg · h-1升高至7.9 mg · h-1.
因此, 本研究以一体式部分亚硝化-厌氧氨氧化(CPNA)工艺为研究对象, 针对CPNA工艺因NOB大量增长导致脱氮效果严重恶化的问题, 一方面考察低剂量投加NH2OH的快速原位恢复CPNA工艺效果, 另一方面考察长期低剂量投加NH2OH对CPNA工艺长期运行稳定性的影响, 并据此研究CPNA工艺原位恢复及其长期运行过程中脱氮性能和功能菌群结构的变化, 从而优化NH2OH投加策略, 为实现厌氧氨氧化工艺的推广应用提供科学依据.
2 材料与方法(Materials and methods)2.1 进水水质与接种污泥本试验采用模拟废水, 进水由NH4HCO3提供NH4+-N, 另投加NaHCO3调整碱度, 二者的物质的量浓度比为1 : 0.5.其他组分及浓度分别为：KH2PO4 10 mg · L-1、CaCl2·2H2O 5.6 mg · L-1、MgSO4·7H2O 300 mg · L-1, 微量元素Ⅰ与微量元素Ⅱ均为1.25 mL · L-1.微量元素储备液Ⅰ由浓度均为5 g · L-1的EDTA、FeSO4配制；微量元素储备液Ⅱ由浓度分别为15、0.014、0.99、0.25、0.43、0.19、0.21、0.22 mg · L-1的EDTA、H3BO4、MnCl2 · 4H2O、CuSO4 · 5H2O、ZnSO4 · 7H2O、NiCl2 · 6H2O、NaSeO4 · 10H2O、NaMoO4·2H2O配制(Van De Graaf et al., 1996).接种污泥一部分来自于本实验室一体式部分亚硝化-厌氧氨氧化反应器, 另一部分来自于本实验室内UASB厌氧氨氧化菌富集装置(陈彦霖等, 2018), 混合后污泥的初始浓度为1.30 g · L-1.该污泥在前期处理模拟废水时长期处于硝酸盐累积、TN去除恶化的环境中, ΔNO3--N/ΔNH4+-N高达0.7, TN去除率仅有20%.
2.2 试验运行试验采用一体式部分亚硝化-厌氧氨氧化(CPNA)工艺(Wang et al., 2016), 部分亚硝化反应与厌氧氨氧化反应在同一个反应器中进行, 由“pH-NH4+-N”和“DO-NH4+-N”模式联合控制.装置为圆柱形SBR反应器(直径为40 cm, 有效容积50 L), 由聚丙烯材料制作而成, 并用深色保温布包裹.反应器配有恒温水浴槽, 可维持反应器内温度恒定在30~35 ℃；底部装有微孔曝气盘, 压缩空气经流量计控制供给所需的溶解氧.
采用连续运行试验, 从第25 d起, 每天向反应器中投加盐酸羟胺, NH2OH初始浓度为1.5 mg · L-1, 低于文献报道的8.25~20 mg · L-1(Harper et al., 2009；Wang et al., 2015；李佳等, 2019).根据脱氮效果和羟胺投加情况, 试验运行分为3个阶段(表 1)：阶段Ⅰ(第0~24 d)未投加羟胺, 脱氮效果差；阶段Ⅱ(第25~70 d)投加羟胺, 脱氮效果恢复；阶段Ⅲ(第71~170 d)投加羟胺, 脱氮效果高效稳定.
表 1(Table 1)
| 表 1 同阶段系统运行参数 Table 1 Operational parameters of the CPNA in different phases | ||||||||||||||||||||||||||||||||
表 1 同阶段系统运行参数 Table 1 Operational parameters of the CPNA in different phases
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2.3 分析方法每周期采集进、出水水样, 依据《水和废水监测分析方法(第四版)》测定相关指标：NH4+-N采用靛酚蓝分光光度法测定；NO2--N采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法测定；NO3--N采用紫外分光光度法测定；污泥浓度采用标准重量法测定.
总氮去除率(Total nitrogen removal efficiency, TNRE)按式(1)计算, 总氮去除负荷(Total nitrogen removal rate, TNRR)的按式(2)计算.
 | (1) |
 | (2) |
采用修正的波尔茨曼模型模拟该原位恢复过程(Jin et al., 2013), 其方程如式(3)所示.
 | (3) |
一体式部分亚硝化-厌氧氨氧化(CPNA)工艺中, 原水中的NH4+-N一部分被AOB氧化成NO2--N, 发生部分亚硝化反应, 接着NO2--N作为电子受体氧化剩余的NH4+-N, 生成N2, 发生厌氧氨氧化反应, 该过程的反应方程式如式(4)所示.
 | (4) |
运行期间每个阶段从反应器中采集污泥样品(第10、40、160 d)进行扫描电镜分析.样品经戊二醛固定、乙醇梯度脱水, 以及无水丙酮处理20 min后, 采用不同梯度无水乙醇与乙酸异戊酯溶液及纯乙酸异戊酯进行置换.随后进行经临界点干燥, 待样品干燥8 h后,用离子溅射镀膜仪在样品表面镀一层金属膜,使用透射电镜(SU-8020型场发射扫描电镜,Hitachi,日本)对样品进行观察拍照(刘涛等, 2012).
对污泥样品(第10、40、160 d)进行基于16S rRNA基因的高通量测序分析.使用MP bio土壤基因组DNA提取试剂盒(MP Biomedicals, Santa Ana, CA)对样品DNA进行提取, 利用1%琼脂糖凝胶电泳验证DNA的完整性后, 对16S rRNA的V4区进行PCR扩增.对扩增结果采用Illumina Miseq平台进行测序分析, 获得的有效测序结果经均一化处理后, 每个样品测序含有32965条序列, 有效序列采用Ribosomal Database Project(RDP)分类, 设定cutoff值为50%进行物种分类, 采用Heml 1.0绘制热图(陈彦霖等, 2018).
3 结果与讨论(Results and discussion)3.1 脱氮性能反应器进出水氮浓度及脱氮性能变化如图 1所示.总氮去除率和总氮去除负荷是评价脱氮系统性能优劣的重要指标, 除此之外, 针对一体式部分亚硝化-厌氧氨氧化(CPNA)工艺, 利用ΔNO3--N/ΔNH4+-N比值, 也就是反应周期内硝酸盐生成量占氨氮去除量的比例来表征系统性能(表 1).阶段Ⅰ(第0~24 d), 未投加NH2OH, 脱氮效果差、硝酸盐积累严重.进水NH4+-N浓度仅为388.9 mg · L-1的情况下, 出水NO3--N浓度高达183.1 mg · L-1, TN去除率仅为18.6%±3.5%, ΔNO3--N/ΔNH4+-N比值在0.73±0.05, 远高于理论值0.11, 亦超出实际工程允许的范围(0.15~0.20).此状况与多处工程实际运行相符, 例如, 瑞士Zürich-Werdh?lzli污水厂在成功运行2年后, 出水NO3--N高达200 mg · L-1, 超过NH4+-N去除量的30%(Adriano et al., 2011)；德国Plettenberg污水厂的脱氨设施在稳定运行数月后, TN去除率从80%下降至40% (Jardin et al., 2012).
图 1(Fig. 1)
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| 图 1 反应器脱氮效果 (进出水氮浓度、总氮去除率及ΔNO3--N/ΔNH4+-N) Fig. 1Reactor nitrogen removal performance (nitrogen concentration of influent and effluent, total nitrogen removal efficiency and ΔNO3--N/ΔNH4+-N ratio) |
阶段Ⅱ(第25~70 d), 开始每天投加NH2OH一次, 其初始浓度为1.5 mg · L-1, 维持进水NH4+-N浓度在500 mg · L-1.经过连续投加, 出水NO3--N浓度从183.1 mg · L-1逐步下降至86.0 mg · L-1, TN去除率从17.5%逐渐升高至85.1%, ΔNO3--N/ΔNH4+-N比值从最高的0.75逐渐下降至0.20以下, 非常接近于理论值0.11, 45 d就实现了CPNA反应器脱氮性能的原位恢复.相比于Wang等(2015)研究, 进水NH4+-N浓度为(693.00±116.93) mg · L-1, NH2OH投加剂量为10~20 mg · L-1, 经过110 d完成原位恢复, 本研究不仅羟胺投加量低, 而且原位恢复时间缩短了41%.
阶段Ⅲ(第71~170 d), 随着反应器脱氮效果的恢复提高, 进水NH4+-N浓度提升至(750.7±52.1) mg · L-1.其他研究中发现, 短期(20 d)的NH2OH投加并不能维持CPNA工艺的长期稳定运行, 停止投加30 d后, 脱氮效果会严重恶化, 需间歇多次投加(李佳等, 2019)；Wang等(2015)研究中发现了类似的现象, 其采用的是NH2OH投加组合SRT控制的策略.为了保证工程可靠性及降低运行难度, 本研究在脱氮效果恢复完成后, NH2OH投加策略不变, 继续保持每天1.5 mg · L-1的剂量投加, 经过长达100 d的运行发现, 出水NO3--N浓度可稳定维持在(86.0±20.4) mg · L-1左右, TN去除率维持在82.2%±4.9%的高水平之上, ΔNO3--N/ΔNH4+-N比值长期维持在理论值0.13±0.03左右, 在第90 d时偶有波动, 但并不存在NO3--N浓度升高、NOB活性恢复的问题.这证明了NH2OH投加对保证CPNA工艺长期稳定运行的有效作用.相比于间歇高剂量NH2OH投加, 长期低剂量投加策略成本可控, 保证性更高.在第85、92和161 d, ΔNO3--N/ΔNH4+-N比值略低于理论值, 可推测系统中存在微弱的反硝化作用, 小部分的NO3--N被还原为N2, 因此, TN去除率得到了提升(Daverey et al., 2015).
经长期低剂量NH2OH投加, 系统恢复且运行稳定, 该过程可由修正的玻尔茨曼模型模拟, 结果如图 2所示, 得到的回归方程如式(5)所示.
 | (5) |
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| 图 2 修正后的玻尔茨曼模型总脱氮负荷拟合结果 Fig. 2The simulation of the recovery of total nitrogen removal rate by the modified Boltzmann model |
CPNA工艺的活性污泥直接决定了生物反应器的性能.TNRR是一个综合指标, 相比于比厌氧氨氧化活性(Specific Anammox Activity, SAA), 可以直接反映受操作条件影响的原位反应速率.模型结果表明, 最大脱氮速率TNRRmax为120 g · m-3 · d-1, 时间中位值tc为44.6 d, 与实际恢复时间相符合.
3.2 活性污泥形态不同阶段的污泥样品(第10、40、160 d)扫描电镜结果如图 3所示.CPNA脱氮工艺中主要菌群为氨氧化菌(AOB)、亚硝酸盐氧化菌(NOB)及厌氧氨氧化菌(AnAOB), 其中, 氨氧化菌(AOB)呈球状或短杆状(Francis et al., 2007), 厌氧氨氧化菌(AnAOB)呈规则或不规则球形或椭球形, 直径为0.8~1 μm.阶段Ⅰ的污泥样品(图 3a)主要由丝状菌、短杆菌和大量粘性物质组成.该阶段TN去除效果较差, 但ΔNH4+-N去除可达60%, 这与AOB有关.投加羟胺处理后, 阶段Ⅱ的污泥样品(图 3b)出现了少量球状菌, 随机散落在丝状菌与粘性物质中.系统脱氮效果在该阶段恢复, 推断与AnAOB的出现有关.而阶段Ⅲ初期的污泥样品(图 3c)中短杆状、球形或椭球形的菌数量显著增多(姚丽等, 2018), 系统脱氮性能长期稳定与功能菌群的数量增多相关, 该结果与后续微生物群落结构变化结果一致.
图 3(Fig. 3)
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| 图 3 NH2OH投加前后污泥扫描电镜图 (a.阶段Ⅰ；b.阶段Ⅱ；c.阶段Ⅲ) Fig. 3SEM images of sludge by NH2OH addition (a.phase Ⅰ; b.phase Ⅱ; c.phase Ⅲ) |
3.3 微生物群落结构运行期间, 微生物群落Alpha多样性指数如表 2所示, 包括了微生物群落的物种多样性和物种丰富度.使用Shannon指数与Simpson指数表达物种多样性, Shannon指数越高与Simpson指数越低, 群落物种多样性越高.使用ACE指数表达物种丰富度, ACE指数越大群落物种丰富度越高.总体而言, 阶段Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的微生物群落多样性下降和特定微生物丰度升高, 说明投加羟胺促进了微生物群落结构向脱氮功能强化方向演替, 这与其他文献报道的结果类似(Ganigué et al., 2012).
表 2(Table 2)
| 表 2 微生物群落的Alpha多样性指数与氮转化功能菌群丰度 Table 2 Indexes of alpha diversity and abundances of functional bacteria | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
表 2 微生物群落的Alpha多样性指数与氮转化功能菌群丰度 Table 2 Indexes of alpha diversity and abundances of functional bacteria
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反应器中微生物菌群结构变化如图 4所示, 其中, 图 4a、图 4b分别反映了门水平与属水平的变化.本研究共检测到35个门, 从门水平来看, 试验初期到稳定运行后期(图 4a), 污泥样品中变形菌门(Proteobacteria)和浮霉菌门(Planctomycetes)的丰度均有明显提升, 分别从27.71%、1.97%提升到45.33%、8.07%.酸杆菌门(Acidobacteria)丰度从8.02%提升到20.93%, 而硝化螺旋菌门(Nitrospirae)丰度明显下降, 从11.14%减少到1.27%.这反映出属于变形菌门(Proteobacteria)的氨氧化菌(AOB)及属于浮霉菌门(Planctomycetes)的厌氧氨氧化菌(AnAOB)等脱氮功能菌的动态变化情况.除此之外, 绿弯菌门(Chloroflexi)的丰度较高(保持在40%左右), 它常见于自养脱氮系统, 有助于降解死亡生物质和促进细胞聚集(Wang et al., 2017).而放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacterioidetes)的丰度主要在1%~3%, 在各阶段无明显变化.
图 4(Fig. 4)
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| 图 4 NH2OH投加前后微生物群落结构变化 (a.门水平；b.属水平) Fig. 4Changes of microbial communities by NH2OH dosing (a.phylum level; b.genus level) |
属水平观测到的微生物群落结构变化趋势与门水平一致, 图 4b展示了每个样品前10位属微生物群落的丰度变化.氨氧化菌(AOB)主要包括亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)和亚硝化球菌属(Nitrosococcus), 其中, Nitrosomonas的丰度从13.4%增加至25.9%, 但并未发现文献中关注较多的Nitrosococcus.本研究发现两种厌氧氨氧化菌属Candidatus Kuenenia和Candidatus Brocadia, 与多数研究发现一致.试验初期, 二者丰度均较低, 但Candidatus Kuenenia丰度高于Candidatus Brocadia, 分别为3.43%和0.08%.在脱氮效果恢复过程中, Candidatus Kuenenia丰度增长显著, 最高可达22.86%, 随后稳定在15%左右；而Candidatus Brocadia有少量增长, 但未超过1%.Candidatus Kuenenia成为优势厌氧氨氧化菌属, 可能与其对NO2--N的较高亲和力有关, 可以利用较低浓度的NO2--N(Narita et al., 2017；(Zhang et al., 2017)并采用K策略在NO2--N基质缺乏的环境中生长(Kang et al., 2019).亚硝酸盐氧化菌(NOB)主要包括硝化螺旋菌属(Nitrospira)和硝化杆菌属(Nitrobacter), 但本研究并未发现Nitrobacter, 可能与试验体系长期处于低DO(＜0.1 mg · L-1)环境有关.已有研究表明, Nitrospira比Nitrobacter对DO的亲和力更强, 可以利用较低浓度的溶解氧(Sui et al., 2020).本试验初期, Nitrospira的丰度高达28.22%, 但随着羟胺的投加, 其丰度降到2.74%以下, 这与NH2OH能够抑制NOB活性(Harper et al., 2009)有关.上述这些结果表明, 长期投加低剂量NH2OH在升高AOB与AnAOB菌属丰度的同时, 可有效抑制和减少NOB丰度, 维持系统运行稳定, 但需要考虑经济性.
4 结论(Conclusions)1) 低剂量投加羟胺可快速原位恢复CPNA工艺.通过向脱氮性能差的CPNA反应器低剂量投加NH2OH(1.5 mg · L-1), 45 d后TN去除率可恢复至82.2%±4.9%以上, ΔNO3--N/ΔNH4+-N比值从0.73±0.05逐渐降低至0.13±0.03.
2) 长期低剂量投加NH2OH有利于维持CPNA工艺的长期稳定运行.长达100 d内低剂量投加NH2OH, CPNA工艺的TN去除率保持在82.2%±4.9%以上, ΔNO3--N/ΔNH4+-N比值可长期稳定在0.13±0.03.
3) 16S rRNA高通量测序表明, 长期低剂量投加NH2OH有助于提高CPNA工艺的AOB和AnAOB丰度, 抑制NOB, 利于微生物群落向稳定脱氮方向演替.
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