传统观点认为，细胞中的蛋白质由核糖体翻译mRNA的编码区（CDS）产生。近年来，人们通过捕获核糖体正在翻译的RNA片段进行高通量测序发现，核糖体还可以翻译mRNA中CDS上游或下游的非翻译区（UTR）以及一些非编码RNA。许多研究表明，这些由UTR和非编码RNA上翻译事件构成的非经典翻译组，在生物体的发育调控、胁迫响应和免疫应答过程以及肿瘤等人类疾病中发挥着重要功能。作为非经典翻译组的主要组成部分，uORF是起始密码子位于5' UTR中的开放阅读框。陆剑课题组对uORF的功能和演化进行了长期的研究，首次发现uORF的演化受到正选择驱动[1]，并解析了uORF在果蝇发育过程中的调控作用[1]，揭示了uORF和miRNA如何组合使用调控基因表达[2]。在此基础上，课题组受邀发表综述文章，总结并展望这一领域的研究[3]。
虽然uORF在真核生物中普遍存在，uORF在不同物种以及不同基因中的分布规律还缺乏系统的研究，有多少uORF的翻译产物可能编码有功能的蛋白质也尚不清楚。为了解决这些基本问题，课题组的研究人员分析了478个物种的高质量基因组注释。通过对这些物种中鉴定到的大约1700万个uORF的分析，研究人员发现真核生物中的uORF整体上受到纯化选择（216种动植物中的概况见下图）。比较分析表明，不同物种间uORF的相对多少主要由有效种群大小决定，有效种群越小的物种中，uORF受到的纯化选择较弱，实际观测到的uORF跟预期的uORF数目更接近。同一个物种的不同基因携带uORF数目呈现很大差异，他们发现，一个基因携带uORF数目的多少主要受基因表达量影响，表达越高的基因携带的uORF数目越少。另一方面，物种中新固定下来的uORF也受到正选择驱动，而且这一趋势在高表达的基因中更明显。
研究中涉及到的216种多细胞动植物的概况。左图为这些物种的系统发生关系；中间为不同进化支上35个代表性物种中蛋白质编码基因的5' UTR注释情况；右图为代表性物种中实际观察到的uORF起始密码子uAUG的数目跟预期的数目的比值。
为了区分uORF的主要功能是调控作用还是编码蛋白质，研究人员对uORF的起始密码子和开放阅读框的序列进行了比较。他们发现，uORF的起始密码子远比其阅读框本身更加保守，uORF的开放阅读框中非同义突变和同义突变的比例也更加符合中性演化。基于此，研究人员得出uORF的主要功能是调控作用而不是编码小肽。他们进一步推测可能编码有功能的蛋白质的uORF所占的比例不到1%，这也跟质谱数据中很难检测到uORF编码的蛋白质的结果相符。
综上所述，该研究揭示了有效种群大小和基因表达量如何跟自然选择共同作用，决定uORF在不同物种和不同基因中的分布。通过对uORF序列演化和质谱数据的分析，研究发现uORF的主要功能是作为顺式调控元件，而不是编码蛋白质。此外，该研究还发现，相对于以AUG作为起始密码子的经典uORF，以CUG、GUG等密码子起始的非经典uORF更不保守，对CDS翻译的抑制作用也更弱。这些发现为我们理解uORF的演化和功能提供了很多新的见解。
陆剑研究员为该研究的通讯作者，生科院博士后张宏为第一作者，陆剑课题组的博士后王奕蓉（现为湖南大学生物学院副教授）、博士研究生吴鑫凯、唐小鹿和吴长城也为该工作作出了重要贡献。该工作得到了国家科技部、国家自然科学基金委和中国博士后基金会的资助。
参考文献：
1.Zhang H, Dou S, He F, Luo J, Wei L, Lu J. Genome-wide maps of ribosomal occupancy provide insights into adaptive evolution and regulatory roles of uORFs during Drosophila development. PLoS Biology. 2018;16(7):e2003903. doi: 10.1371/journal.pbio.2003903.
2.Zhang H, Wang Y, Tang X, Dou S, Sun Y, Zhang Q, et al. Combinatorial regulation of gene expression by uORFs and microRNAs in Drosophila. Science Bulletin. 2020. doi: 10.1016/j.scib.2020.10.012.
3.Zhang H, Wang Y, Lu J. Function and Evolution of Upstream ORFs in Eukaryotes. Trends in Biochemical Sciences. 2019;44(9):782-94. doi: 10.1016/j.tibs.2019.03.002.
