摘要： 【目的】羧酸酯酶（carboxylesterase, COE）是昆虫体内一类重要的解毒酶，与昆虫的抗药性相关。本研究旨在对中华按蚊Anopheles sinensis羧酸酯酶Ae7(Asae7)进行初步晶体学研究，为解析AsAe7的空间结构及探讨其分子功能奠定基础。【方法】首先对Asae7进行生物信息学分析，然后进行分子克隆，并利用原核表达系统在体外对Asae7进行重组表达；结合Ni-NTA金属螯合层析和葡聚糖凝胶层析方法纯化融合表达蛋白；通过葡聚糖凝胶层析和化学交联结果分析AsAe7的聚合状态；采用坐滴气相扩散法对AsAe7进行结晶筛选。【结果】生物信息学分析表明，AsAe7是亲水性蛋白，分子量为61.053 kD，无跨膜区和信号肽；3D结构预测结果分析显示，AsAe7采取的是α/β-水解酶超家族折叠模式。多序列比对结果表明，在不同昆虫中Ae7蛋白具有高度保守性。分子克隆得到中华按蚊AsAe7的编码基因Asae7序列，大小为1 626 bp。成功构建重组质粒pET28a-Asae7；在大肠杆菌Escherichia coli中表达的融合蛋白AsAe7主要分布在上清中。通过镍柱亲和层析和凝胶过滤层析纯化出了高纯度且稳定的目的蛋白；通过凝胶过滤层析和化学交联获得纯化的AsAe7主要呈单体状态；同时通过晶体筛选获得了AsAe7的晶体。【结论】运用结晶学的方法初步获得了AsAe7的晶体，为后续解析AsAe7的晶体结构以及在原子分辨率水平上直观阐释AsAe7参与代谢抗性的分子机制奠定了基础。
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中华按蚊α-羧酸酯酶AsAe7的异源表达、纯化与结晶
本站小编 Free考研考试/2022-01-03
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