基于数据依赖的扫描模式（data-dependent acquisition，DDA）和数据非依赖的扫描模式（data-independent acquisition，DIA）的非标记定量（label-free quantitative，LFQ）和同位素标记TMT（tandem mass tag）定量是蛋白质组学定量中较常见的技术. 本文利用最新的Orbitrap Exploris 480质谱，优化了DDA、FAIMS DDA、FAIMS DIA的非标记定量方法以及TMT定量策略的关键质谱参数，并将其应用在人细胞蛋白质组、单细胞蛋白质组、血浆蛋白质组和酵母蛋白质组分析. 结果表明，在DDA实验中，设置碰撞能量为27、二级谱图的分辨率为15 K、最大离子注入时间为22 ms是最佳的参数组合. 针对极微量样品200 pg~5 ng，可以根据样品量相应设置最佳的质谱参数. 使用200 pg和500 pg的HeLa细胞样品，分别鉴定到1 259和1 725个蛋白质，从而实现了单细胞蛋白质组学的深度覆盖. 在FAIMS DDA实验中，60 min或90 min梯度时选择CV-45V的补偿电压，120 min或150 min梯度时选择CV-45V-65V补偿电压组合，可以获得最佳的蛋白质鉴定结果. 从293T蛋白质组中分别在60、120和150 min中鉴定6 300、6 994和7 500个蛋白质. 在FAIMS DIA实验中，使用CV-45V-65V双补偿电压切换，60个隔离窗口来获得最佳的蛋白质鉴定数目和定量重现性. 在60 min内分别在293T细胞和去除高峰度的血浆中定量到7 019个细胞蛋白和1 077个血浆蛋白. 在TMT定量实验中设置APD开启、“Precursor Fit”阈值70和Turbo TMT功能的组合同时增加了TMT定量蛋白质的数量和TMT定量的准确性. 在TMT11-plex标记的酵母蛋白质组中60 min即可定量10 989个多肽和2 162个蛋白质. 综上所述，本研究中优化的多种非标记定量和TMT定量方法为Orbitrap Exploris 480在蛋白质组学更广泛的应用提供了参考.
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Orbitrap Exploris 480质谱在定量蛋白质组学应用中的优化和评测
本站小编 Free考研考试/2022-01-02
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